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牛流行热(bovine ephemeral fever,BEF)是由牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus)引起的一种牛的非接触性的虫媒病毒性疾病,该病引起牛的高热、流产,役用牛跛行和瘫痪,奶牛的产奶量下降,对养殖业造成重大损失。BEFV编码有5种结构蛋白和其他未知功能的蛋白,其中G蛋白是主要的免疫原性蛋白,其表面存在4个抗原位点,G1为BEFV所特有,且G1抗原位点在BEFV中很保守。目前,国内外均没有商品化的诊断BEFV或其抗体的试剂盒。另外,在国内外检测牛流行热病毒或其抗体的方法,有RT-PCR、LAMP、实时荧光定量PCR、微量中和试验等方法,但是这些方法几乎没有用于临床样品的筛查,这些检测方法需要昂贵的实验设备、试剂、耗材以及专业的技术人员,不适于野外样品的调查,无法广泛的应用于基层和大规模的流行病学调查。本研究对包含部分抗原表位的BEFV G1基因片段进行克隆表达、纯化,进行反应原性和特异性分析,最后以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测BEFV抗体间接ELISA诊断方法,并且成功开发了试剂盒,对中国部分地区2822份血清进行流行病学调查。同时,本研究也针对BEFV的免疫保护基因G基因的G1抗原表位,合成单克隆抗体,作为包被抗体(捕获抗体),以抗BEFV的高免血清(多克隆抗体)作为追踪抗体,建立了检测牛流行热病毒抗原的抗原捕获ELISA方法,并且对200份野外的全血样品对其进行了评价。研究结果如下:1.以本实验室保存的BEFV(LYC11株)的G基因质粒为模板,根据GenBank上登录的BEFV(LYC11株)全病毒基因组序列设计特异性引物,通过PCR扩增得到包含G1基因的DNA片段,经测序验证后,用原核表达系统进行表达,经过反应原性和特异性分析,证明该重组蛋白具有很好的反应原性,只与抗BEFV的抗体进行反应。2.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了检测BEFV抗体的间接ELISA方法,并且对该方法进行优化,开发了BEFV抗体检测间接ELISA试剂盒,使其可以稳定的应用于临床样品的检测。3.以开发的试剂盒对我国26个省份的2822份血清进行了检测,BEFV抗体的阳性率为0%-81%,并且对血清学调查结果进行了详细的讨论。4.针对根据GenBank登录的BEFV(LYC11株)G1基因序列合成了抗-G1抗原位点的单克隆抗体,并且对其反应性和特异性进行评估,结果证明,该单克隆抗体具有良好的反应性和特异性,并对其效价进行评估。5.以合成的单克隆抗体和多克隆抗体分别为捕获抗体和追踪抗体,建立了检测BEFV抗原的抗原捕获ELISA方法,利用200份临床样品对该方法进行进一步评价,成功建立了检测BEFV抗原的AC-ELISA方法。