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碳青霉烯类药物抗菌谱广,抗菌活性强。近年来,临床中对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株逐渐增多,给感染性疾病的治疗带来了巨大的困难和挑战。产碳青霉烯酶是细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一,携带碳青霉烯酶基因的质粒是耐药基因在菌株间快速传播的重要载体。本研究的主要目的是深入研究IncHI5型质粒,以及3类来自假单胞属菌的新型质粒(Incp RBL16、IncpCT14和Incp ND6-2)的遗传特征。通过16S rDNA初步核定菌种,改良Carbapenemase Nordmann Poirel法检测碳青霉烯酶类型,VITEK 2检测药物敏感性,结合菌株背景资料,将产碳青霉烯酶的菌株进行350bp微生物小片段库二代全基因组测序。获得二代全基因组序列后,通过平均核苷酸一致性值比对进行菌种核定,Res Finder进行耐药基因筛查,Plasmid Finder筛选已知复制子,明确质粒类型,将包含目标复制子或复制子较新的菌株进行测序,获得完整质粒序列,并对其进行精细注释和比较基因组学分析。同时对深入研究的菌株进行接合转移或电转化实验,获得相应的接合子或电转子。第一章对收集到的4株产B类碳青霉烯酶且包含IncHI5型质粒的肺炎克雷伯菌进行了深入研究,并分别获得了菌株A324的接合子A324-IMP-EC600和电转子A324-IMP-TOP10。pA324-IMP、p11219-IMP、p12208-IMP和p13190-VIM均为IncHI5型质粒。本研究纳入分析的质粒除了上述4个质粒,还包括另外两个从Gen Bank中检索到的IncHI5型质粒,即pKp NDM1和p KP04VIM。6个质粒均包含IncHI5型质粒的保守骨架结构:rep HI5B和rep FIB-like、par ABC以及tra1和tra2。p A324-IMP的骨架区最完整,为该类质粒的参考质粒。IncHI5型质粒能够通过水平转移的方式整合多种类型的外源插入区,外源插入导致的周围骨架结构的截短或缺失是引起骨架结构差异的主要原因。IncHI5型质粒的外源插入区种类较多,其中包含耐药基因的外源插入区有3种:Tn10,以及抗生素耐药岛ARI-A和ARI-B。ARI-A和ARI-B分别插入在orf342的下游和xer C2内部。ARI-A和ARI-B分别由Tn1696和Tn6535进化而来,为完整转座子或转座子类似结构。不同IncHI5型质粒的ARI-A和ARI-B包含不同的耐药基因及相关移动元件,是促进耐药基因快速传播的重要载体,复杂的转座和同源重组是这些区域形成的主要推动力。第二章对收集到的8株产B类碳青霉烯酶且包含Incp RBL16型质粒的假单胞属菌株进行了深入研究。本研究纳入分析的质粒共17个,8个从上述8菌株中获得的质粒,以及另外9个从Gen Bank中检索到的质粒（包括我们实验室前期研究中的p12969-DIM和p SY153-MDR）。17个质粒均来自假单胞属菌,均不能归于现有的不相容群,为新型Incp RBL16质粒,均包含该类质粒的保守骨架结构:rep AIncp RBL16和其重复子、parB2–parA、che、pil和ter。pRBL16无任何外源插入,且骨架区最完整,为该类质粒的参考质粒。17个质粒的结构差异主要表现在18个区域或位点,包括:外源插入、外源插入引起的骨架序列截短或缺失,以及骨架基因的序列置换。17个质粒包含至少71种非冗余外源插入区,如:Tn1403相关区域、Tn7家族转座子、Tn6571家族转座子、可整合和接合的元件,及可整合和动员的元件。17个质粒包括40种（15类）抗生素或重金属抗性基因。不同的Incp RBL16型质粒包含不同的外源插入区,进而包含不同的耐药基因及相关移动元件,该类质粒也是耐药基因在假单胞属菌中传播的重要载体。此外,p12939-PER是首次报道的携带blaOXA-246的Incp RBL16型质粒,p12939-PER和p A681-IMP是首次报道的携带blaPER的Incp RBL16型质粒。本研究共包括14个首次发现和31个首次命名的移动元件。第三章对收集到的产B类碳青霉烯酶且包含IncpCT14型质粒的假单胞属菌918607,进行了深入研究。本研究纳入分析的质粒共2个,即本次测序质粒p918607-IMP和来自Gen Bank的质粒pCT14,二者均为新型IncpCT14型质粒,都包含该类质粒的保守骨架结构:rep AIncpCT14及其iterons、krf A–vag CD–stb ABC和cpl–rlx。pCT14是最早测序的质粒,为该类质粒的参考质粒。p918607-IMP和pCT14分别有1个（In994）和2个外源插入区（ISPa17和cbz区）。p918607-IMP中blaIMP-1位于简单1型整合子In994上。cbz区包含降解氯邻苯二酚的基因,且其中的Tn6729是本研究新命名的转座子。IncpCT14型质粒骨架可整合不同类型的外源插入区,促进耐药基因在假单胞属菌中的传播。第四章对收集到的产B类碳青霉烯酶且包含Incp ND6-2型质粒的铜绿假单胞菌PA15W和201330进行了深入研究,测序共获得两个Incp ND6-2型质粒,即p201330-IMP和p PA15W-NR。本研究纳入分析的质粒共3个,p201330-IMP和p PA15W-NR,以及从Gen Bank检索到的质粒p ND6-2。3个质粒均为新型Incp ND6-2型质粒,其中p ND6-2测序时间最早,是该类质粒的参考质粒。3个质粒均包含Incp ND6-2型质粒的保守骨架结构repIncp ND6-2及其iterons,par BA、mva T、top A、ssb和maz EF,dot DCBA、pilus区和icm BJCGEKL。3个质粒仅有p201330-IMP包括2个外源插入区,即Tn6411和Tn5563相关区域。p201330-IMP中blaIMP-1位于1型整合子In992上,In992位于Tn7家族转座子Tn6411上。Incp ND6-2型质粒的骨架能够整合携带耐药基因的外源插入区,促进耐药基因在假单胞属菌中的传播。综上所述,通过对4类质粒的测序、精细注释及比较基因组学分析,我们更好地拆分了每类质粒的骨架区和外源插入区,更全面地认识了每类质粒骨架区和外源插入区的保守性及多态性,从更深层次理解了每类质粒的进化历史和遗传特性,为公共卫生部门和临床工作者提供一定的理论指导,延缓耐药发展趋势。