论文部分内容阅读
新德里金属β-内酰胺酶-1(NewDelhimetallo-β-lactamase1,NDM-1)导致革兰氏阴性细菌对几乎所有的β-内酰胺类抗生素产生抗性。携带NDM-1编码基因(blaNDM-1)的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和不动杆菌属(Acinetobacter spp)细菌在世界各地广泛地流行,严重威胁着公共健康。blaNDM-1的流行病学和遗传学研究显示,质粒的接合转移是blaNDM-1传播的主要方式。因此考察携带blaNDM-1质粒细菌的接合转移机制对于了解blaNDM-1的传播特征具有重要的意义。近年来的研究表明,细菌的群体感应(Quorum sensing,QS)通过相关调控蛋白对接合转移进行调控,而细菌的Ⅳ型分泌系统(Type 4 secretion system,T4SS)又在接合转移的过程中起着关键作用。针对我国blaNDM-1的主要携带菌株不动杆菌,为探索其群体感应系统调控blaNDM-1接合转移的机制,完成了以下研究。
首先,利用微量肉汤稀释法和绘制生长曲线考察群体感应相关化合物对携带blaNDM-1的皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)XM1570和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α∷pBR322生长特性的影响。结果表明:XM1570和DH5α∷pBR322对群体感应相关化合物链霉素、吲哚、顺-9-十六碳烯酸、HSL均耐药;1μg/mL链霉素和1mM吲哚对XM1570和DH5α∷pBR322的生长均具有显著抑制作用;40μMHSL对XM1570和DH5α∷pBR322的生长均具有显著促进作用。
其次,利用接合转移实验考察群体感应相关化合物对XM1570-DH5α∷pBR322接合转移效率的影响,利用荧光定量PCR的方法考察群体感应相关化合物对下游相关基因表达水平的影响。结果表明:1μg/mL链霉素、1mM吲哚和20μg/mL顺-9-十六碳烯酸对XM1570-DH5α∷pBR322接合转移均具有显著抑制作用;40μMHSL对XM1570-DH5α∷pBR322接合转移具有显著促进作用;1μg/mL链霉素对Ⅳ型分泌系统相关基因virB4和ISAba14、ISAba125家族转座酶基因的表达水平均具有显著抑制作用;1mM吲哚和20μg/mL顺-9-十六碳烯酸对接合转移相关基因traA和ISAba14、ISAba125家族转座酶基因的表达水平均具有显著抑制作用;40μMHSL对virB4、traA和ISAba14、ISAba125家族转座酶基因的表达水平均具有显著促进作用。
最后,利用分子生物学技术构建pET-28a-apiR重组表达载体,表达并鉴定群体感应调控蛋白ApiR,利用凝胶迁移实验考察ApiR蛋白的调控结合位点。结果表明:ApiR蛋白的调控结合位点分别在接合转移相关基因traA起始密码子上游203bp序列内和ISAba14家族转座酶基因起始密码子上游215bp序列内。
综上所述,皮特不动杆菌XM1570的群体感应系统通过群体感应调控蛋白ApiR来调节接合转移相关基因traA和ISAba14家族转座酶基因的表达水平,从而调控其携带blaDNM-1质粒的接合转移。本研究初步揭示了这一机制,为此类超级耐药细菌的防控和新型药物的开发提供了新的思路。
首先,利用微量肉汤稀释法和绘制生长曲线考察群体感应相关化合物对携带blaNDM-1的皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)XM1570和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α∷pBR322生长特性的影响。结果表明:XM1570和DH5α∷pBR322对群体感应相关化合物链霉素、吲哚、顺-9-十六碳烯酸、HSL均耐药;1μg/mL链霉素和1mM吲哚对XM1570和DH5α∷pBR322的生长均具有显著抑制作用;40μMHSL对XM1570和DH5α∷pBR322的生长均具有显著促进作用。
其次,利用接合转移实验考察群体感应相关化合物对XM1570-DH5α∷pBR322接合转移效率的影响,利用荧光定量PCR的方法考察群体感应相关化合物对下游相关基因表达水平的影响。结果表明:1μg/mL链霉素、1mM吲哚和20μg/mL顺-9-十六碳烯酸对XM1570-DH5α∷pBR322接合转移均具有显著抑制作用;40μMHSL对XM1570-DH5α∷pBR322接合转移具有显著促进作用;1μg/mL链霉素对Ⅳ型分泌系统相关基因virB4和ISAba14、ISAba125家族转座酶基因的表达水平均具有显著抑制作用;1mM吲哚和20μg/mL顺-9-十六碳烯酸对接合转移相关基因traA和ISAba14、ISAba125家族转座酶基因的表达水平均具有显著抑制作用;40μMHSL对virB4、traA和ISAba14、ISAba125家族转座酶基因的表达水平均具有显著促进作用。
最后,利用分子生物学技术构建pET-28a-apiR重组表达载体,表达并鉴定群体感应调控蛋白ApiR,利用凝胶迁移实验考察ApiR蛋白的调控结合位点。结果表明:ApiR蛋白的调控结合位点分别在接合转移相关基因traA起始密码子上游203bp序列内和ISAba14家族转座酶基因起始密码子上游215bp序列内。
综上所述,皮特不动杆菌XM1570的群体感应系统通过群体感应调控蛋白ApiR来调节接合转移相关基因traA和ISAba14家族转座酶基因的表达水平,从而调控其携带blaDNM-1质粒的接合转移。本研究初步揭示了这一机制,为此类超级耐药细菌的防控和新型药物的开发提供了新的思路。