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目的：
观察健脾活血方治疗萎缩性胃炎伴癌前病变的临床疗效，并初步探索其疗效机制；建立恶性转化胃上皮细胞模型，观察健脾活血方含药血清对其的影响，并探索其发挥作用的机制。挖掘中医药治疗萎缩性胃炎伴癌前病变的新方法，为本病的临证用药提供参考及理论支撑。
方法：
1.搜索CNKI、WANFANG、SinoMed、VIP、Cochrane、Pubmed、Embase数据库中近20年关于中医药治疗萎缩性胃炎伴癌前病变的临床文献并进行文献筛选，运用中医传承辅助系统(V2.5)，录入方药证治数据，建立数据集。利用“数据统计”、“统计报表”等模块，运用关联规则、复杂系统熵聚类等统计手段，分别对所有胃癌前病变，注明肠上皮化生，注明不典型增生，注明异型增生的方药进行分析，包括药物四气五味归经统计、频次统计、治法统计、组方分析、新方分析。
2.搜索CNKI、WANFANG、SinoMed、VIP、Cochrane、Pubmed、Embase数据库中近20年关于健脾活血法依据治疗萎缩性胃炎伴癌前病变的临床研究并进行文献筛选，利用Cochrane系统评价手册对纳入的文献进行质量评价，Revman5.3软件对干预方法的临床总有效率、胃镜改善率、病理缓解率、Hp根除有效率进行meta分析，并记录不良反应。
3.搜索GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中胃黏膜低级别上皮内瘤变与慢性胃炎差异基因的相关芯片，提取基因数据集，利用PERL软件，R语言中的程辑包，提取差异基因及其交集，并绘制热图、火山图、韦恩图，利用R语言，对筛选出的差异基因进行GO富集分析和KEGG富集分析；运用string数据库(https://www.string-db.org/)，构建差异基因的蛋白互作网络(PPI)，并筛选出核心基因。
4.临床研究。以随机数字表法将62名患者分为观察组和对照组，每组各31例，观察组予以健脾活血方(摩罗丹配伍三七粉)，对照组给予叶酸片，疗程均为24周。观察比较两组的临床有效率、治疗前后的症状评分(主症/次症评分，症状总评分)、胃镜评分、病理评分，同时进行治疗前、治疗中、治疗后的安全性评估；免疫荧光法检测观察组患者治疗前后胃黏膜中Toll样受体4(Toll Like Receptor 4，TLR4)、P53、上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)相关分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达情况。
5.体外实验。利用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)刺激人胃上皮细胞(GES-1细胞)，诱导其恶性转化，构建恶性转化的胃上皮细胞(T-GES-1)模型。以健脾活血方含药血清、叶酸片含药血清为干预药物，分六组：A组：GES-1细胞+正常大鼠含药血清；B组：GES-1细胞+MNNG+正常大鼠含药血清；C组：GES-1细胞+MNNG+叶酸片含药血清；D组：GES-1细胞+MNNG+健脾活血含药血清；E组：GES-1细胞+MNNG+健脾活血含药血清+TLR4激动剂；F组：GES-1细胞+MNNG+正常大鼠含药血清+TLR4激动剂。观察细胞形态，利用CCK-8检测经MNNG/含药血清干预24小时、48小时、72小时后细胞的活力；利用划痕实验检测各组细胞的迁移率；流式凋亡检测各组细胞的凋亡率；实时荧光定量PCR检测各组细胞中Vimentin、N-cadherin、E-cadherinmRNA的表达；WB检测各组细胞中TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB蛋白的表达；免疫荧光法检测各组细胞中P53、Ki67、Muc2的表达，并对结果行统计学分析。
结果：
1.经筛选，共纳入232篇文献，包括252首方剂，233味药。药性总体偏平，药味以多归于脾、胃、肝经，健脾活血治法运用最多；使用频次最高的治法为健脾活血法、化浊解毒法、滋养胃阴法、疏肝和胃法，不同病理类型各有侧重；治疗PLGC频次最高的药物是甘草、白术、莪术、黄芪、白花蛇舌草等，治疗PLGC的组方常用的是“白术、甘草”，“黄芪、甘草”，“黄芪、白术”，“莪术、黄芪”，“甘草、白芍”、“丹参、甘草”等，不同病理类型各有侧重，并形成常用组合网络图；提取治疗PLGC的核心组合16个，新方8个，提取治疗肠上皮化生、不典型增生、异型增生的核心组合各8个，新方各4个，并形成新方网络图。
2.最终纳入39篇RCT文献，共有3786名受试者，其中健脾活血法治疗组1994名，对照组1792名。文献质量评价显示：有21篇为随机数字表法随机分组，18篇提及随机分组，但未阐述随机方法。2篇为双盲双模拟，1篇采用模拟药物单盲。有6篇在结局观测指标描述中的例数与原始例数不符，且未说明失访原因；meta分析显示：健脾活血法临床有效率优于对照组[RR=1.25，95%CI(1.21，1.30)]；胃镜改善率优于对照组[RR=1.39，95%CI(1.28，1.52)]；病理改善率优于对照组[RR=1.48，95%CI(1.38，1.60)]；中医症状有效率优于对照组[RR=1.25，95%CI(1.13， 1.38)]；Hp根除有效率优于对照组[RR=1.25，95%CI(1.14，1.37)]，39篇文献中，有14篇文献描述了研究过程中观察不良反应，其中12篇描述未出现不良反应，2篇中有出现不良反应，包括便秘6例(对照组2/60，观察组4/60)、腹痛1例(对照组1/60)、口干3例(对照组1/60，观察组2/60)、腹泻1例(对照组1/90)、头痛1例(对照组1/90)、皮疹1例(对照组1/90)。
3.选取GSE55696、GS87666E数据集，筛选出差异基因121个，其中上调基因42个，下调基因79个。差异基因主要分布于细胞颗粒腔、细胞内小泡、高密度脂蛋白颗粒等中；差异基因参与的生物过程主要是激素代谢过程，白细胞趋化过程，cGMP的信号途径等；主要作用涉及有钾离子通道运转、氧化还原、模式识别受体活动等。差异基因参与的通路包括白介素17(IL17)通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)通路、花生四烯酸代谢通路、促性腺激素释放激素(GnRH)分泌通路。
4.临床研究结果显示，经卡方检验分析，观察组临床有效率高于对照组(卡方值=6.613，P＜0.05)；观察组治疗后中医症状总评分较治疗前降低(P＜0.01)，且低于对照组(P＜0.01)，观察组主要症状胃脘疼痛、饱胀、痞满、嗳气、纳差评分均降低(P＜0.01)，其中饱胀、痞满、嗳气、纳差积分低于对照组治疗后(P＜0.05)；观察组次要症状疲乏、睡眠差、嘈杂、反酸评分降低(P＜0.01)，且低于对照组治疗后(P＜0.05)。观察组治疗后胃镜评分中胃镜下黏膜色泽评分、血管透见度评分、黏膜隆起评分、红斑评分、胃镜总积分较治疗前降低(P＜0.05)，其中粘膜色泽评分、红斑评分、胃镜总评分低于对照组治疗后(P＜0.01)；观察组治疗后病理评分中肠上皮化生评分、异型增生评分较治疗前降低(P＜0.01)，其中异型增生评分低于对照组(P＜0.05)。经安全性监测，摩罗丹配伍三七粉安全性良好。观察组治疗后胃黏膜中TLR4、P53、Vimentin表达较治疗前下降(P＜0.01)，且低于对照组(P＜0.01)；观察组治疗后胃黏膜中E-cadherin表达增高(P＜0.01)，且高于对照组(P＜0.01)。
5.体外研究结果显示：正常的GES-1贴壁生长，细胞呈梭形，形态规则，经MNNG处理后细胞形态逐渐不规则，呈现多边形。CCK-8检测显示，MNNG对GES-1细胞有一定细胞毒性，呈浓度依赖性，时间对其影响甚微，至MNNG浓度为40μmol/L时GES-1活性呈断崖式下降，20μmol/L时抑制率为30%左右，选择20μmol/L，24h造模，含药血清对细胞活性的影响呈浓度依赖型，无明显时间依赖，选择15%，24h干预。经MNNG处理后GES-1细胞的迁移率升高、凋亡率下降、EMT上升(P＜0.05)，P53、Ki67、Muc2表达上升(P＜0.05)，TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达上升(P＜0.05)；给予健脾活血含药血清后，上诉情况缓解(P＜0.05)，且优于加入叶酸片含药血清组(P＜0.05)；在MNNG诱导的GES-1细胞中加入TLR4激活剂后，上述情况加重(P＜0.05)，同时加入TLR4激动剂及健脾活血含药血清，情况优于前者(P＜0.05)。
结论：
1.健脾活血方治疗脾虚血瘀型萎缩性胃炎伴癌前病变临床疗效显著，且安全性良好，值得临床推广。
2.健脾活血方可改善萎缩性胃炎伴癌前病变患者胃黏膜P53、TLR4的表达，且可缓解EMT，这可能是其发挥作用的机制。
3.健脾活血方含药血清可抑制恶性转化胃上皮细胞的恶性特征，优于叶酸片含药血清，其机制为通过调控TLR4/MyD88/NF-κB，抑制EMT而发挥疗效。
观察健脾活血方治疗萎缩性胃炎伴癌前病变的临床疗效，并初步探索其疗效机制；建立恶性转化胃上皮细胞模型，观察健脾活血方含药血清对其的影响，并探索其发挥作用的机制。挖掘中医药治疗萎缩性胃炎伴癌前病变的新方法，为本病的临证用药提供参考及理论支撑。
方法：
1.搜索CNKI、WANFANG、SinoMed、VIP、Cochrane、Pubmed、Embase数据库中近20年关于中医药治疗萎缩性胃炎伴癌前病变的临床文献并进行文献筛选，运用中医传承辅助系统(V2.5)，录入方药证治数据，建立数据集。利用“数据统计”、“统计报表”等模块，运用关联规则、复杂系统熵聚类等统计手段，分别对所有胃癌前病变，注明肠上皮化生，注明不典型增生，注明异型增生的方药进行分析，包括药物四气五味归经统计、频次统计、治法统计、组方分析、新方分析。
2.搜索CNKI、WANFANG、SinoMed、VIP、Cochrane、Pubmed、Embase数据库中近20年关于健脾活血法依据治疗萎缩性胃炎伴癌前病变的临床研究并进行文献筛选，利用Cochrane系统评价手册对纳入的文献进行质量评价，Revman5.3软件对干预方法的临床总有效率、胃镜改善率、病理缓解率、Hp根除有效率进行meta分析，并记录不良反应。
3.搜索GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中胃黏膜低级别上皮内瘤变与慢性胃炎差异基因的相关芯片，提取基因数据集，利用PERL软件，R语言中的程辑包，提取差异基因及其交集，并绘制热图、火山图、韦恩图，利用R语言，对筛选出的差异基因进行GO富集分析和KEGG富集分析；运用string数据库(https://www.string-db.org/)，构建差异基因的蛋白互作网络(PPI)，并筛选出核心基因。
4.临床研究。以随机数字表法将62名患者分为观察组和对照组，每组各31例，观察组予以健脾活血方(摩罗丹配伍三七粉)，对照组给予叶酸片，疗程均为24周。观察比较两组的临床有效率、治疗前后的症状评分(主症/次症评分，症状总评分)、胃镜评分、病理评分，同时进行治疗前、治疗中、治疗后的安全性评估；免疫荧光法检测观察组患者治疗前后胃黏膜中Toll样受体4(Toll Like Receptor 4，TLR4)、P53、上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)相关分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达情况。
5.体外实验。利用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)刺激人胃上皮细胞(GES-1细胞)，诱导其恶性转化，构建恶性转化的胃上皮细胞(T-GES-1)模型。以健脾活血方含药血清、叶酸片含药血清为干预药物，分六组：A组：GES-1细胞+正常大鼠含药血清；B组：GES-1细胞+MNNG+正常大鼠含药血清；C组：GES-1细胞+MNNG+叶酸片含药血清；D组：GES-1细胞+MNNG+健脾活血含药血清；E组：GES-1细胞+MNNG+健脾活血含药血清+TLR4激动剂；F组：GES-1细胞+MNNG+正常大鼠含药血清+TLR4激动剂。观察细胞形态，利用CCK-8检测经MNNG/含药血清干预24小时、48小时、72小时后细胞的活力；利用划痕实验检测各组细胞的迁移率；流式凋亡检测各组细胞的凋亡率；实时荧光定量PCR检测各组细胞中Vimentin、N-cadherin、E-cadherinmRNA的表达；WB检测各组细胞中TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB蛋白的表达；免疫荧光法检测各组细胞中P53、Ki67、Muc2的表达，并对结果行统计学分析。
结果：
1.经筛选，共纳入232篇文献，包括252首方剂，233味药。药性总体偏平，药味以多归于脾、胃、肝经，健脾活血治法运用最多；使用频次最高的治法为健脾活血法、化浊解毒法、滋养胃阴法、疏肝和胃法，不同病理类型各有侧重；治疗PLGC频次最高的药物是甘草、白术、莪术、黄芪、白花蛇舌草等，治疗PLGC的组方常用的是“白术、甘草”，“黄芪、甘草”，“黄芪、白术”，“莪术、黄芪”，“甘草、白芍”、“丹参、甘草”等，不同病理类型各有侧重，并形成常用组合网络图；提取治疗PLGC的核心组合16个，新方8个，提取治疗肠上皮化生、不典型增生、异型增生的核心组合各8个，新方各4个，并形成新方网络图。
2.最终纳入39篇RCT文献，共有3786名受试者，其中健脾活血法治疗组1994名，对照组1792名。文献质量评价显示：有21篇为随机数字表法随机分组，18篇提及随机分组，但未阐述随机方法。2篇为双盲双模拟，1篇采用模拟药物单盲。有6篇在结局观测指标描述中的例数与原始例数不符，且未说明失访原因；meta分析显示：健脾活血法临床有效率优于对照组[RR=1.25，95%CI(1.21，1.30)]；胃镜改善率优于对照组[RR=1.39，95%CI(1.28，1.52)]；病理改善率优于对照组[RR=1.48，95%CI(1.38，1.60)]；中医症状有效率优于对照组[RR=1.25，95%CI(1.13， 1.38)]；Hp根除有效率优于对照组[RR=1.25，95%CI(1.14，1.37)]，39篇文献中，有14篇文献描述了研究过程中观察不良反应，其中12篇描述未出现不良反应，2篇中有出现不良反应，包括便秘6例(对照组2/60，观察组4/60)、腹痛1例(对照组1/60)、口干3例(对照组1/60，观察组2/60)、腹泻1例(对照组1/90)、头痛1例(对照组1/90)、皮疹1例(对照组1/90)。
3.选取GSE55696、GS87666E数据集，筛选出差异基因121个，其中上调基因42个，下调基因79个。差异基因主要分布于细胞颗粒腔、细胞内小泡、高密度脂蛋白颗粒等中；差异基因参与的生物过程主要是激素代谢过程，白细胞趋化过程，cGMP的信号途径等；主要作用涉及有钾离子通道运转、氧化还原、模式识别受体活动等。差异基因参与的通路包括白介素17(IL17)通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)通路、花生四烯酸代谢通路、促性腺激素释放激素(GnRH)分泌通路。
4.临床研究结果显示，经卡方检验分析，观察组临床有效率高于对照组(卡方值=6.613，P＜0.05)；观察组治疗后中医症状总评分较治疗前降低(P＜0.01)，且低于对照组(P＜0.01)，观察组主要症状胃脘疼痛、饱胀、痞满、嗳气、纳差评分均降低(P＜0.01)，其中饱胀、痞满、嗳气、纳差积分低于对照组治疗后(P＜0.05)；观察组次要症状疲乏、睡眠差、嘈杂、反酸评分降低(P＜0.01)，且低于对照组治疗后(P＜0.05)。观察组治疗后胃镜评分中胃镜下黏膜色泽评分、血管透见度评分、黏膜隆起评分、红斑评分、胃镜总积分较治疗前降低(P＜0.05)，其中粘膜色泽评分、红斑评分、胃镜总评分低于对照组治疗后(P＜0.01)；观察组治疗后病理评分中肠上皮化生评分、异型增生评分较治疗前降低(P＜0.01)，其中异型增生评分低于对照组(P＜0.05)。经安全性监测，摩罗丹配伍三七粉安全性良好。观察组治疗后胃黏膜中TLR4、P53、Vimentin表达较治疗前下降(P＜0.01)，且低于对照组(P＜0.01)；观察组治疗后胃黏膜中E-cadherin表达增高(P＜0.01)，且高于对照组(P＜0.01)。
5.体外研究结果显示：正常的GES-1贴壁生长，细胞呈梭形，形态规则，经MNNG处理后细胞形态逐渐不规则，呈现多边形。CCK-8检测显示，MNNG对GES-1细胞有一定细胞毒性，呈浓度依赖性，时间对其影响甚微，至MNNG浓度为40μmol/L时GES-1活性呈断崖式下降，20μmol/L时抑制率为30%左右，选择20μmol/L，24h造模，含药血清对细胞活性的影响呈浓度依赖型，无明显时间依赖，选择15%，24h干预。经MNNG处理后GES-1细胞的迁移率升高、凋亡率下降、EMT上升(P＜0.05)，P53、Ki67、Muc2表达上升(P＜0.05)，TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达上升(P＜0.05)；给予健脾活血含药血清后，上诉情况缓解(P＜0.05)，且优于加入叶酸片含药血清组(P＜0.05)；在MNNG诱导的GES-1细胞中加入TLR4激活剂后，上述情况加重(P＜0.05)，同时加入TLR4激动剂及健脾活血含药血清，情况优于前者(P＜0.05)。
结论：
1.健脾活血方治疗脾虚血瘀型萎缩性胃炎伴癌前病变临床疗效显著，且安全性良好，值得临床推广。
2.健脾活血方可改善萎缩性胃炎伴癌前病变患者胃黏膜P53、TLR4的表达，且可缓解EMT，这可能是其发挥作用的机制。
3.健脾活血方含药血清可抑制恶性转化胃上皮细胞的恶性特征，优于叶酸片含药血清，其机制为通过调控TLR4/MyD88/NF-κB，抑制EMT而发挥疗效。