肌腱缺损是临床常见疾病,由于肌腱结构和功能的特殊性,术后极易发生粘连,导致损伤肌腱功能恢复不全或完全丧失。目前,主要采用自体肌腱移植、同种异体肌腱移植和人工肌腱替代等进行治疗,除了供体来源有限,还要面临疾病传染、免疫排斥和修复不充分等风险。随着细胞移植技术、生物材料科学的发展,一种较理想的肌腱替代物——组织工程肌腱有望解决缺损肌腱的修复问题。制备和筛选生物相容性优异、力学性能匹配、生物可降解性好的支架材料是组织工程技术的重要内容之一。本室前期研究发现,柞蚕丝纤维具有良好的细胞相容性,体内植入一定时间内能够保持较好的力学强度,但是,天然柞蚕丝具有高度的结晶结构,难以降解,体内实验受到局限。柞蚕丝纤维经脱胶、粉碎、水解可以得到天然柞蚕丝素蛋白粉(WSF),由于较高的结晶度,WSF仅在硫氰酸鲤等少数溶剂中可以完全溶解。因此,本研究提出通过制备再生柞蚕丝素蛋自(RWSF)来提高其溶解性,同时,将RWSF与高分子材料聚乙烯醇(PVA)共混,应用静电纺丝技术制备PVA/RWSF复合纳米纤维,充分发挥两种材料的优点,在保持支架材料的力学强度及降解行为不变的前提下,获得具有生物活性的表面。本研究首先探索使用熔融的硝酸钙对WSF进行再生处理制备RWSF;然后以电纺液浓度、PVA与RWSF配比、纺丝电压、推进速度和接收距离作为正交试验的五个因素,优选电纺制备PVA/RWSF复合纳米纤维的最佳工艺参数；最后对PVA/RWSF复合纳米材料的理化性能、降解性及细胞相容性、体内修复效果等进行考察,探讨其作为肌腱组织工程支架的可行性。实验结果如下：一、建立了一种成本低廉、高效地制备RWSF的方法。在温度100℃,浴比1/20条件下加热处理4h,加水透析48h,冷冻干燥24h,RWSF得率可以达到64.15%±3.72%。制备的RWSF溶解性增强,在甲酸中最大溶解率可达3%。傅里叶红外光谱检测表明,再生处理使WSF的分子构象由β-折叠向α-螺旋和无规卷曲方向转变。二、通过正交试验优选出PVA/RWSF复合纳米纤维最佳电纺参数为：电纺液浓度9%、PVA/RWSF配比90/10、纺丝电压18KV、推进速度1.5ml/h、接收距离14cm,制备出的纤维均一、纤细,重复性好。三、电纺制备的PVA/RWSF复合纳米纤维材料,表面均匀、平整,呈微黄色。扫描电镜观察,电纺纤维彼此交错排列形成三维多孔网状结构,无粘连现象,纤维的直径、孔径和孔隙率分别为244±103nm、1177±393nm和90.8±2.58%。吸水率和接触角实验结果证实,RWSF的加入改善了支架的亲水性。力学检测显示,PVA/RWSF复合纳米支架具有较好的极限拉伸强度和断裂伸长率,能够模拟天然细胞外基质所需的力学强度。FTIR检测发现,PVA/RWSF电纺膜构象以无规卷曲为主,PVA与RWSF彼此间未形成新的化学键,仅以物理方式混合。四、体外降解实验表明,PVA、PVA/RWSF支架材料在PBS溶液中降解较慢,12周时残余质量比为85.53%±1.0%。在多酶降解液中,两种材料都表现出较高的降解速度,12周时残余质量比达到70%左右。SD大鼠体内植入两周后取材发现,植入材料已被一层透明薄膜包裹起来,两种材料在体内的降解速率与体外PBS水解速率接近。分析认为PVA/RWSF复合纳米材料体内降解时间与损伤肌腱修复时间吻合。支架材料浸提液毒性实验显示,NIH3T3成纤维细胞在PVA/RWSF支架浸提液中生长形态正常、折光性强、贴壁良好,与阴性对照组相似。PVA、PVA/RWSF组的毒性反应均为1级,说明各材料浸提液均无细胞毒性。支架与细胞复合培养24h后,细胞几乎将支架表面完全覆盖,基本上观察不到纤维形态,36h后细胞已完全覆盖支架表面,特别是PVA/RWSF支架表面出现了细胞分层现象。MTT法测定粘附细胞0D值显示,PVA/RWSF组支架细胞粘附率与培养板接近,显著高于PVA组和盖玻片组(p<0.05),说明RWSF的加入提高了PVA材料的细胞粘附能力。五、构建SD大鼠肌腱缺损模型,应用改良“8”字型缝合法,以PVA/RWSF复合支架进行体内修复。实验结果显示,术后4周伤口己完全愈合,术后12周支架表面被一层透明组织包裹,部分实验组吻合端出现缝合连接脱落现象；HE染色证明,随着修复时间的延长,炎症细胞逐渐减少,术后12周基本消失,肌纤维排列整齐有序,同时支架表面有大量细胞粘附,支架内腔被细胞和其他组织填满；免疫组化染色观察,术后12周PVA/RWSF支架表面粘附的细胞I型胶原表达呈阳性,Ⅲ型胶原表达很少；力学测试结果显示,材料的极限拉伸强度和断裂伸长率在植入的早期都有不同程度的降低,并随着时间的延长逐渐稳定。实验证明,PVA/RWSF复合支架体内修复效果较好,可以为损伤肌腱早期修复提供足够的拉伸强度和生物力学稳定性,在组织工程支架材料领域有较大的应用潜力。