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背景目前胃癌是临床上常见的消化道肿瘤之一,胃癌大约占消化道肿瘤的95%以上,在每年确诊的恶性肿瘤疾病中,胃部肿瘤位居第四位。是当今世界发病率仅次于肺癌的疾病,死亡率位居世界第二位,已经严重的影响到了人们的身体健康。人体靶向位点的发现,是肿瘤治疗的新突破,为肿瘤患者带来了希望,它主要是通过靶向药物与人体特定的靶向位点相结合来发挥抑制肿瘤细胞的作用,促使肿瘤细胞凋亡。目前针对胃癌治疗的靶向位点比较多,但大多都不成熟。有研究表明FHL2(Four and a half LIM domain 2)与胃癌的发生、发展及预后都有着密切的联系,通过研究FHL2的组成、功能及传导途径,或许可以为肿瘤靶向治疗提供一个新的靶向位点。虽然FHL-2是目前研究热门的靶向位点之一,由于对FHL2的研究还存在很多的疑问,所以未能在临床中应用。本文通过研究FHL2的蛋白表达及相关蛋白在胃癌中的表达及意义,进一步的了解FHL2与胃癌之间的关系,为胃癌的靶向治疗提供新的靶点。目的1.胃癌细胞上皮-间质转化模型的建立;2.揭示FHL-2与胃癌上皮-间质转化的相关性方法1.胃癌细胞上皮-间质转化模型的建立1.1胃癌上皮细胞间质样表型的诱导间质样实验组:采用10ug/ml奥沙利铂持续刺激人胃癌细胞系SGC-823(上皮细胞表型),诱导其成为胃癌上皮细胞间质样表型;对照组:正常的人SGC-823(上皮细胞表型)。1.2形态学观察:将培养瓶的培养液倒尽,使用1-2mlPBS溶液,洗涤细胞两次,用移液器将残留的PBS溶液小心吸除干净,加入5ml含有10%胎牛血清的1640培养液。用倒置相差显微镜观察对照组和实验组细胞形态,先从100X镜下观察细胞形态,并选取较为典型两种细胞进行观察,随后继续用200X倍镜观察并记录细胞形态改变。1.3 Transwell实验分别将实验所获得的成对数生长的胃癌SGC-823细胞株(上皮细胞表型)及诱导而成的间质样细胞表型,置于小室的上室,并调整其细胞悬液的浓度为2.5×10~5个/ml,向下室中加入含10%胎牛血清的培养液500μl,连续培养24h,用棉签小心刮去上室中未通过膜的细胞,室温条件下,进行固定、染色,随后用PBS溶液快速洗涤,自然风干,再倒置相差显微镜来分别观察两组细胞的侵袭能力改变。胃癌细胞上皮-间质转化模型评估。2.HL-2、E-钙黏蛋白和波形蛋白在胃癌细胞上皮-间质转化模型中表达水平采用Western blot实验对FHL-2、E-钙黏蛋白和波形蛋白在胃癌细胞上皮-间质转化模型中表达水平进行半定量分析:将不同浓度的分离胶和浓缩进行电泳,电泳结束后进行转膜到PVDF膜上,然后进行染色,观察蛋白条带,将洗涤好的蛋白条带置于4℃过夜24小时,用TBST低速摇床反复洗膜,每次5min,加入二抗37℃杂交2小时后,最后加入荧光剂,置于暗室中进行曝光显影。3.数据分析收集实验组和对照组的数据,采用SPSS13软件,首先对数据进行正态分布检验,正态分布数据采用均数±标准差的方式表示,采用两样本独立t检验进行统计学分析,以α=0.05为检验水准,若P>α,则表明两组间差异无统计学意义;若P<α,则表明两组间差异具有统计学意义。结果1.胃癌细胞上皮-间质转化模型的建立1.1两组胃癌细胞形态学变化:实验组细胞表型由上皮样细胞表型向间质样细胞表型发生转变,主要表现为:细胞形态大小不一,伴有明显的伪足出现;对照组细胞表型以上皮样细胞表型为主,主要表现为:类圆形,细胞间缝隙较小,大小形状较为规则。1.2 Transwell实验结果:对照组穿过膜的细胞数为65.7±11.65,实验组穿过膜的细胞数为123.4±28.13,计算得出T=12.434,P﹤0.05,说明差异具有统计学意义,实验组细胞的侵袭能力较对照组细胞的侵袭能力明显增强。2.HL-2、E-钙黏蛋白和波形蛋白在胃癌细胞上皮-间质转化模型中表达水平Western bolt结果:与对照组相比较,实验组波形蛋白和FHL2表达水平上调,而E-钙黏蛋白表达下调,差异有统计学意义。结论1.奥沙利铂持续刺激是建立胃癌细胞上皮-间质转化模型的有效方法;2.FHL-2蛋白与胃癌细胞上皮间质转化过程密切相关,FHL-2可能会成为肿瘤靶向治疗的一个关键位点,在胃癌细胞发生上皮间质转化的过程中,通过干预FHL2的表达可能会为逆转该过程提供新的思路。