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第一部分神经活动依赖的蛋白质硫巯基化信号对大鼠海马脑区长时程增强的调控作用目的：硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是一种重要的内源性气体信号分子,近年来由于其与多种神经退行性疾病密切相关受到广泛关注。离子型谷氨酸受体,特别是N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR),在长时程增强(long-term potentiation,LTP)和长时程抑制(long-term depression, LTD)等突触可塑性形成中扮演着关键性的角色。有研究发现,外源性补充H2S通过激活NMDAR易化海马脑区LTP,但其机制未明。最新研究显示,H2S通过靶向蛋白质的半胱氨酸残基进行硫巯基化修饰(sulfhydration, SHY,由巯基-SH转变为硫巯基-SSH),改变靶蛋白的空间结构,从而调控其活性和功能。但是迄今为止,这种内源性的新型蛋白质翻译后修饰,在突触可塑性中发挥何种作用还鲜有报道。因此,本部分实验旨在研究,神经活动依赖的内源性硫巯基化信号分子H2S,在大鼠海马脑区突触可塑性中扮演的角色。方法：给予高频刺激(high-frequency stimulation, HFS)或高钾刺激,采用亚甲基蓝法检测上述处理对大鼠海马脑片H2S含量的影响；给予5-磷酸毗哆醛(pyridoxal- 5’-phosphate, PLP)依赖的H2S合成酶抑制剂羟胺(hydroxylamine, NH2OH)或氨基-氧乙酸(amino-oxyacetate,AOA)进行药理学阻断,检测上述处理在HFS条件下对大鼠海马脑区H2S含量的影响,并运用场电位记录实验方法检测上述处理对大鼠海马脑区Schaffer侧支至CA1通路LTP的影响；借助慢病毒表达的短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA) LV-CBS-RNAi,沉默脑中内源性H2S合成酶胱硫醚-p-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS) ,再孵育H2S的外源性供体硫氢化钠(sodium hydrogen sulfide, NariS)或补充NMDAR的共激活剂D型丝氨酸(D-serine),检测上述处理对大鼠海马脑区LTP的影响；孵育Nails或降解内源性D-serine的D型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAAO)或给予过量D-serine,检测上述处理对大鼠海马脑区LTP的影响；建立一种DAAO催化依赖的卤化物荧光法,测定H2S对大鼠海马脑片、原代培养的神经元细胞及星形胶质细胞D-serine水平的影响。结果：(1) HFS(100 Hz)和高钾刺激(50 mM)显著增加大鼠海马脑区H2S含量(Control: 100.00%±3.26%, HFS: 129.74%±2.81%; Control: 100.00%±2.55%, High KCI: 114.29% ±.93%);(2) HFS诱导的大鼠海马脑区内源性H2S生成,能被NH2OH (200μM)或AOA (100μM)所阻断(Control: 100.00%±3.26%, HFS: 129.74%±2.81%, HFS+NH2OH: 98.39%±4.82%, HFS+AOA: 101.98%±2.15%); (3) NH2OH (200μM)或AOA(100μM)均能造成大鼠海马脑区Schaffer侧支至CA1通路LTP损伤(Control: 150.85%±5.08%, AOA: 106.42%±3.84%, NH2OH: 120.59%±5.17%); (4) LV-CBS-RNAi沉默H2S合成酶CBS表达(LV-vector: 100.00%±15.01%, LV-CBS-RNAi: 54.23%±3.39%),显著损伤海马脑区LTP (LV-veetor: 133.06%±3.58%, LV-CBS-RNAi: 100.05%±1.35%) ,外源性孵育Naris (100μM)或过量D-serine (100μM)均可逆转LV-CBS-RNAi所致大鼠海马脑区LTP损伤(LV-CBS-RNAi+NaHS: 158.50%±5.71%, LV-CBS-RNAi+D-serine: 176.33 % ±8.19%); (5)NailS (100 μM)显著增强大鼠海马脑区LTP (Controh 135.58%±1.40%,NaHS：167.17%±2.58%),这种改变可以被DAAO (0.5U/mL)所阻断(DAAO:117.00% ±3.03%, DAAO+NaHS: 117.36%±2.86%) ;(6)预孵育过量的D-serine (100 μM)能取消Nails(100 μM )引起的大鼠海马脑区LTP的进一步增强(D-serine: 169.18%±4.90%, D-serine+NaHS: 164.14%±2.17%); (7) Nails浓度依赖性(0μM, 50μM, 100μM)地上调大鼠海马脑区D-serine水平(Control: 100.00%±11.53%, 50μM: 130.94%±3.14%, 100 μM: 162.75%±7.50%) ,这种改变可能主要来源于星形胶质细胞(星形胶质细胞Control: 103.95%±7.93%, NailS: 133:20%±6.76%;神经元Control; 100.00%±14.42%, NaHS:111.87%±16.83%)。结论：神经活动诱导PLP依赖的、尤其是CBS依赖的内源性H2S生成,对于NMDAR-LTP的形成是必需的,并且能够通过星形胶质细胞源性D-serine依赖的途径,易化大鼠海马脑区Schaffer侧支至CAl通路的UTP。第二部分神经活动依赖的蛋白质硫巯基化信号调控大鼠海马脑区长时程增强的机制目的：本课题研究认为H2S对海马LTP的调控作用和D-serine密切相关。谷氨酸释放触发星形胶质细胞源性D-serine释放,但具体机制鲜为人知。丝氨酸消旋酶(serine racemase,SR)作为D-serine的合成酶,与H2S的重要合成酶CBS都表达于星形胶质细胞中。因此,本部分实验旨在探索,内源性硫巯基化信号分子H2S是否通过对SR的硫巯基化修饰作用来增强其活性,上调其产物D-serine水平,从而易化大鼠海马脑区的突触可塑性。方法：建立DAAO催化依赖的卤化物荧光法,测定H2S对SR活性的影响；使用SR活性抑制剂L-丝氨酸-O-硫酸酯(L-serine-O-suifate, LSOS)检测其对D-serine水平的改变；应用生物素开关法检测H2S对SR硫巯基化修饰和亚硝基化修饰的影响；观察二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT,能够打断二硫键从而阻断硫巯基化修饰)对SR硫巯基化修饰的影响；给予大鼠海马脑片不同频率电刺激或高钾刺激,检测上述处理对海马脑区总蛋白和SR硫巯基化修饰的影响；大鼠海马脑片孵育NAILS或LSOS检测上述处理对海马脑区LTP的影响；借助电喷雾离子化质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)技术检测NariS脱气水溶液中多硫化物(polysulfides, H2Sn)的相对丰度；大鼠海马脑片孵育多硫化物供体四硫化钠(sodium tetrasulfide, Na2S4),观察其对大鼠海马脑区LTP的影响；采用年龄相关学习记忆损伤(aBe-associated memory impairment, AAMI)的衰老大鼠模型,观察外源性补充H2S对衰老后D-serine缺乏导致突触可塑性损伤的恢复作用。结果：(1)孵育Naris ( 100μM)显著上调大鼠海马脑区和体外重组蛋白的SR活性(大鼠海马Control: 100.00% ±1.49%, NariS: 157.50% ±6.71%;重组蛋白Control: 100.00% ±1.38%, NariS: 137.40%±1.05%) ,并且这种改变能被LSOS (4.5 raM)所阻断(Control: 100.00% ±11.53%, LSOS: 86.51% ±2.65%, NariS: 135.82% ±15.61%, NaHS+LSOS: 91.27% ±6.91%):(2)SR的硫巯基化修饰改变可能来源于其亚硝基化状态(Control: 100.98%±10.73%,Vitamin C: 313.26% ± 15.25%, NariS: 321.82% ± 35.94%, NariS+Vitamin C: 324.37% ± 30.18%) ; (3) NaHS浓度依赖性(0μM, 50μM, 100μM )地上调大鼠海马脑区总蛋白的硫巯基化修饰水平；(4) NariS ( 100μM )显著上调大鼠海马脑区和体外重组蛋白的SR硫巯基化修饰水平(大鼠海马Control: 99.88%±5.60%, NaHS: 413.57%±48.34%:重组蛋白Control: 95.00% ±2.99%, NaHS: 439.81%±33.10%)并且NariS引起的SR活性改变被DTT(50μM)所阻断(重组蛋白DTT: 100.00%±4.66%, NaHS±DTT: 108.53%:±1.13%;大鼠海马DTT: 100.00%±2.99%, NaHS±DTT: 96.37%±9.31%):(5)不同频率的刺激(0Hz, 1 Hz, 10Hz, 100 Hz)可上调大鼠海马脑区SR的硫巯基化修饰水平,且具有频率依赖性(0 Hz: 100.73%±5.29%, 1 Hz: 204.64%±11.19%, 10 Hz: 322.57%± 13.89%, 100 Hz: 506.08%±17.35%) ,高钾刺激(50 mM)也显著上调大鼠海马脑区SR的硫巯基化修饰水平(Control: 100.19%±5.54%, High KCl: 181.32%±10.86%): (6) NariS( 100 μM)增强大鼠海马脑区LTP的作用可被LSOS (4.5 mM)所阻断(LSOS: 106.51% ±06%, NaHS+LSOS: 105.69%±2.73%): (7) HFS (100Hz)显著上调大鼠海马脑区D-serine水平(Control:100.00%±9.55%, HFS: 140.77%±8.38%) ,并可被NHzOH (200μM)或AOA ( 100μM )所阻断(NH2OH: 94.35%±6.00%, HFS+NH2OH: 94.76%±5.27%, AOA: 95.06%±3.35%, HFS+AOA: 95.82%±5.43%) ; (8) NaHS脱气水溶液(100μM)中检测到多种不同丰度的多硫化物离子峰([S3]-, [S4]-, [S5]2-, [S6]2-, IS7]2-, [88]2-); (9)多硫化物供体Na2S4 (25μM)显著增强大鼠海马脑区的LTP (Control: 143.04%±3.86%, Na2S4: 168.26%±2.70%),并逆转LV-CBS-RNAi造成的LTP损伤(LV-CBS-RNAi: 100.05 % ±1.35%, LV-CBS-RNAi+Na2S4: 162.78%±7.17%): (10)衰老大鼠海马脑区H2S含量下降(Adult: 100.00%±5.13%, Aged: 66.49%±1.74%)、总蛋白及SR蛋白的硫巯基化水平下调(Adult: 106.32±3.59%, Aged: 55.12%±5.78%)以及LTP损伤,外源性补充NariS(100μM)恢复总蛋白及SR蛋白的硫巯基化水平(Aged: 105.80%±2.13%, Aged+NailS: 283.44±38.98%), D-serine水平(Aged: 100.00%±5.14%, Aged+NariS: 235.56%±24.09%)以及LIP (Aged: 113.44%±3.50%, Aged+NariS: 153.68%±3.98%)。结论：硫巯基化信号分子H2S通过形成多硫化物硫巯基化修饰SR来增强其催化活性,上调其产物D-serine的水平,从而易化大鼠海马脑区Sehaffer侧支至CA1通路的LTP;外源性补充H2S恢复D-serine信号通路,能够一定程度上逆转衰老后D-serine缺乏导致的突触可塑性损伤。