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背景和目的:2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)为一种慢性代谢性疾病,在全球范围内具有较高的发病率,给社会带来严重的经济负担。因此,急需寻找安全、高效的治疗T2DM的药物。研究表明小檗碱(Berberine,BBR)在降低血糖,改善胰岛素抵抗,调节血脂,抑制肠道葡萄糖吸收等方面发挥重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)被认为是BBR抗氧化应激的重要上游分子之一,而BBR是否能够在胰岛β细胞内激活AMPK的表达仍然未知。近期研究表明血管内皮细胞中磷酸酶-张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)的下调或者缺失能够改善胰岛素靶器官的葡萄糖代谢。此外研究发现敲除PTEN能减少β细胞凋亡,但目前其具体作用机制尚未明确。因此,在本研究中我们通过棕榈酸(Palmic acid,PA)诱导胰岛βTC6细胞的凋亡,观察在BBR干预下胰岛βTC6细胞的增殖、凋亡、氧化应激及AMPK、PTEN和Nrf2表达的变化,进而阐释BBR对高FFAs环境下胰岛βTC6细胞的保护作用及其具体作用机制。研究方法:第一部分:培养胰岛βTC6细胞,然后分别用不同浓度的PA(0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L)及BBR(0.001、0.01、0.1、1.0、10、100μmol/L)处理细胞,MTT检测各组细胞的凋亡情况。第二部分:对胰岛βTC6细胞进行不同处理,分为对照组(Con),1 mmol/L棕榈酸组(PA组)及0.1μmol/L小檗碱组(PA+BBR组)。采用免疫荧光及Western blotting检测PA及BBR各组相关信号转录因子AMPKa、PTEN及Nrf2的表达水平;各组胰岛βTC6细胞的凋亡情况采用由流式细胞术的方法来检测。第三部分:对胰岛βTC6细胞进行不同处理,分为对照组(Con),阴性对照siRNA转染细胞组(NC)、PTEN敲减细胞组(siRNA)、正常细胞+1 mmol/L棕榈酸组(PA)、阴性对照siRNA转染细胞组+1 mmol/L棕榈酸组(NC+PA)、PTEN敲减细胞组+1mmol/L棕榈酸组(siRNA+PA)、正常细胞+1 mmol/L棕榈酸+0.1μmol/L小檗碱组(PA+BBR)、阴性对照siRNA转染细胞组+1 mmol/L棕榈酸+0.1μmol/L小檗碱(NC+PA+BBR)、PTEN敲减细胞组+1 mmol/L棕榈酸+0.1μmol/L小檗碱(siRNA+PA+BBR)。PTEN的敲减效率由RT-PCR的方法进行检测;各组胰岛βTC6细胞的增殖情况由MTT法进行检测;各组细胞的凋亡情况通过流式细胞术来检测;各组细胞的AMPKα、PTEN、Nrf2 mRNA及蛋白的表达水平分别由RT-PCR及Western blotting的方法进行检测;各组Caspase3、硝基酪氨酸(NT)及IL-6的含量由ELISA的方法进行检测;利用荧光探针检测各组ROS的含量。研究结果:第一部分:1.MTT结果显示1.0 mmol/L的PA处理组βTC6细胞存活率最低。2.MTT结果显示0.1μmol/L的BBR组βTC6细胞存活率最高。第二部分:1.免疫荧光结果显示与对照组相比,PA处理组胰岛βTC6中AMPKa蛋白表达没有显著变化(P>0.05),而PTEN及Nrf2表达显著上升(P<0.05)。在用BBR治疗后,与PA组相比,AMPKa的蛋白表达仍旧没有显著变化(P>0.05),而PTEN及Nrf2表达较PA组显著下降(P<0.05)。2.Western blotting检测结果显示与对照组相比,PA处理组胰岛βTC6中AMPKa蛋白表达没有显著变化(P>0.05),而PTEN及Nrf2蛋白表达显著升高(P<0.05)。在用BBR治疗后,与PA组相比,AMPKa的蛋白表达仍旧没有显著变化(P>0.05),而PTEN及Nrf2的蛋白表达显著下降(P<0.05)。3.流式细胞术检测显示与对照组相比,PA处理组胰岛βTC6细胞的凋亡率显著上升(P<0.05),而BBR处理组胰岛βTC6细胞的凋亡率较PA组显著下降(P<0.05)。第三部分:1.RT-PCR及Western blotting结果显示与NC组相比,PTEN的mRNA及蛋白水平在转染siRNA-1、siRNA-2及siRNA-3后均显著下降(P<0.05)。特别地,siRNA-1的沉默效率最显著。2.MTT结果显示敲减PTEN后,无论是PA还是BBR处理的胰岛βTC6细胞,其存活率均呈现上升趋势。3.流式细胞术及ELISA结果显示与正常细胞和NC组细胞相比,PTEN敲除后对细胞的Capase-3的表达及细胞凋亡均无显著影响(P>0.05)。而与PA组和NC+PA组相比,PTEN敲除后Capase-3的含量显著下降(P<0.05)。4.RT-PCR及Western blotting结果显示敲PTEN后,siRNA+PA组及siRNA+PA+BBR组Nrf2 mRNA及蛋白的表达显著升高(P<0.05),而AMPK的mRNA及蛋白表达没有显著变化(P>0.05)。5.荧光探针结果显示敲减PTEN后,各组βTC6细胞中ROS的含量出现减少的情况。6.ELISA结果显示敲减PTEN后各组βTC6细胞中NT的含量均显著下降(P<0.05)。7.动物试验证明与Con组相比,BBR组糖尿病小鼠的血糖含量呈降低趋势,糖尿病小鼠的炎症反应也有一定程度的减轻。8.ELISA结果显示Con组相比,IL-6的表达在DM组及MET组中显著升高(P<0.05)。BBR治疗组中IL-6的表达较DM组显著下降(P<0.05)。类似地,与MET组相比,BBR+MET组中IL-6的表达亦显著下降(P<0.05)。结论:BBR通过下调PTEN来发挥对胰岛βTC6的保护作用,一方面PTEN下调后能够抑制βTC6细胞的凋亡并促进其增殖;另一方面,PTEN的表达被抑制后能够促进Nrf2的表达,进而使βTC6细胞具有抗氧化应激的作用。此外,BBR治疗能够减轻糖尿病小鼠的炎症反应、降低血糖含量,提示BBR具有治疗T2DM的潜能。