论文部分内容阅读
食管癌是常见的恶性肿瘤，其发病机制至今不甚明了。有研究发现HPV感染与食管癌的发病有关，但究竟起何作用并不清楚。为此，本研究联合运用双向凝胶电泳、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、RT-PCR、免疫印迹、反义核酸、裸鼠成瘤等技术手段对HPV18E6E7基因转染诱导的永生化食管上皮细胞SHEE及食管癌细胞SHEEmt之间的差异表达基因进行鉴定，并初步研究了基因的功能，以期为揭示HPV在食管癌发病中的作用提供新线索。内容与方法： 1、提取SHEE和SHEEmt细胞的总蛋白，双向凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染色，PDQuest 6.2软件分析双向凝胶电泳图确定差异表达蛋白，进行MALDI-TOF-MS鉴定。 2、通过RT-PCR确定差异表达蛋白基因的转录水平，并通过cDNA克隆和DNA测序等给予进一步确认。 3、通过免疫印迹对SHEE和SHEEmt细胞中的差异表达蛋白进行验证：通过免疫组织化学检测差异表达蛋白在临床食管鳞癌、腺癌和正常食管上皮组织中的表达情况。 4、在转录水平反义封闭SHEEmt和HeLa细胞中差异表达蛋白基因的表达，观察细胞生物学特性的变化规律，初步确定差异表达蛋白的功能。 结果： 1、双向凝胶电泳和MALDI-TOF-MS发现，与SHEE中的比较，fascin 1和磷酸丙糖异构酶在SHEEmt中在蛋白质翻译层面上表现上调。 2、RT-PCR检测发现，与SHEE中的比较，fascin 1和磷酸丙糖异构酶在SHEEmt中在mRNA转录层面上均表现上调，但相比之下fascin 1mRNA的上调汕头大学医学院硕士学位论文更明显。测序结果显示，所扩增的fascinl基因片段的序列与GenBank上的一致。 3、免疫印迹检测结果显示，与SHEE中的比较，fascinl蛋白在SHEEmt细胞中的表达水平明显增高:免疫组织化学检测fascinl在食管鳞癌和腺癌组织表达呈阳性，在正常食管上皮组织表达呈阴性，而部分增殖旺盛的基底细胞表达呈阳性。 4、构建了fascinl基因编码区部分片段的反义表达载体PcDNA3 .0一fascin(一)，并成功转染 SHEEmt和HeLa细胞。 5、在HeLa细胞中，反义封闭fascinl基因后，细胞的丝状伪足和微棘减少，表现为聚集生长。检测结果表明，fascinl基因在转录水平表现为明显下调，但在蛋白翻译水平相应性下调表现不明显。 6、反义封闭fascinl基因表达对SHEEmt和HeLa细胞的生长周期未见明显影响，sHEEmt一fasein(一)和HeLa一fasein(一)细胞仍可在SCID小鼠成瘤。结论: 1、一与 SHEE中的比较，fascinl基因和磷酸丙糖异构酶基因在SHEEmt中在蛋白质翻译层面上均表达增高。提示fascinl和磷酸丙糖异构酶可能与SHEE细胞的恶性变相关。 2、与SHEE中的比较，fascinl和磷酸丙糖异构酶在SHEEmt中在mRNA转录层面_L均表现上调表达，但相比之下fascin 1 mRNA的上调更明显。 3、fascinl基因在食管鳞癌、腺癌组织和增殖旺盛的正常食管上皮组织基底细胞呈阳性表达，在正常食管上皮组织呈阴性表达，进一步提示fascinl可能与食管癌的发生发展相关。 4、反义封闭fascinl基因表达对SHEEmt和HeLa等细胞的形态有明显影响，但对细胞的分裂增殖和裸鼠体内成瘤影响不明显。