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目的:主动脉瘤是主动脉壁局部或弥漫性的异常扩张,根据解剖部位分为腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)及胸主动脉瘤(thoracic aortic aneurysm,TAA),其产生是多基因、多因素相互作用的结果。在最新的主动脉疾病的诊断和治疗指南中指出,主动脉瘤的发生、发展是一个复杂的过程,其主要的病理学改变包括免疫炎症反应和细胞外基质降解等。TLR4是天然免疫系统的一种模式识别受体,已有研究表明TLR4介导的免疫炎症通路与多种心血管疾病相关,此外,TLR4在维持生理性主动脉内稳态和诱导病理性主动脉表型转化中起着重要作用。MMP9是MMP家族中最重要的成员,具有降解血管壁基质中IV胶原蛋白及弹性蛋白的作用,在主动脉壁重构和主动脉瘤发生、发展中起着重要作用。相关研究表明,MMP9可在血清和动脉壁中高表达,导致主动脉细胞外基质降解、动脉中层退行性变,进而形成主动脉瘤。Li等报道了TLR4信号通路的激活可以诱导人主动脉平滑肌细胞分泌MMP9。Qin等研究证明TLR4拮抗剂或TLR4基因敲除均能减少AAA大鼠模型的主动脉瘤组织MMP2、MMP9激活和前炎症因子释放,并在人体组织中验证TLR4在主动脉瘤中的表达水平较正常组织明显增高。由此可见,TLR4在主动脉瘤病理改变中起着重要作用并发挥着与其他主动脉瘤相关信号通路连接的关键桥梁作用。然而,以上证据普遍基于动物研究,基因关联分析罕见报道。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是最常见的遗传变异形式,这种变异会导致相同基因编码产物的功能不同、个体对疾病的易感性不同、临床表现的多样性、疾病转归及预后的不同。MMP9基因多态性及其表达与主动脉瘤的关系虽然得到一定关注,但研究结果并不统一。然而,关于TLR4基因多态性及其表达与主动脉瘤发病风险的相关研究罕见报道,有待进一步明确。综上所述,本课题旨在探索TLR4和MMP9基因多态性及其差异表达与主动脉瘤发病风险的关系及其分子机制,为主动脉瘤的诊断和个体化治疗提供理论依据。研究方法:1.利用KASP基因型检测技术进行基因多态分型。采用多因素Logistic回归进行多态与疾病发病风险相关性分析。采用Logistic回归的全因子模型和似然比法分析TLR4、MMP9 tagSNP间交互作用以及tagSNP与高血压、糖尿病及血脂异常间交互作用。2.利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TLR4、MMP9蛋白表达。采用Spearman秩相关检验TLR4和MMP9蛋白表达水平之间以及其与主动脉瘤相关血清生物标志物和主动脉瘤最大直径的相关性。采用ROC曲线评价血清TLR4和MMP9表达对主动脉瘤及其亚型的诊断效能。3.利用免疫组织化学法检测主动脉瘤和正常主动脉组织TLR4、MMP9蛋白含量,比较TLR4、MMP9组织蛋白表达水平差异。4.比较TLR4、MMP9 tagSNP不同基因型间血清及组织蛋白表达水平差异。5.利用荧光素酶报告系统检测TLR4rs1927914多态不同等位基因报告质粒的荧光素酶活性,比较不同等位基因启动子活性差异。结果:1.TLR4、MMP9基因多态性与主动脉瘤发病风险关联分析MMP9rs17576 AA基因型携带者发生主动脉瘤和AAA的风险增加(OR=1.897,95%CI=1.132-3.177;OR=2.291,95%CI=1.253-4.190)。在隐性模型中,rs17576的AA基因型携带者显著增加主动脉瘤和AAA的发病风险。TLR4rs1927914 TC基因型能够增加男性人群主动脉瘤的发病风险(OR=1.435,95%CI=1.029-2.002,P=0.033)。MMP9rs17576 AA基因型和隐性模型(AA vs.GA+GG)与增加男性主动脉瘤及其亚型的发病风险相关,此外,也可显著增加≤60岁人群患主动脉瘤和AAA的风险。2.TLR4、MMP9基因多态交互作用与主动脉瘤发病风险的关联分析TLR4rs1927914显性模型与MMP9rs17576隐性模型存在交互作用,能够显著增加TAA的发病风险(Pinteraction=0.038,OR=6.186)。携带rs17576 AA基因型的rs1927914显性模型和携带rs1927914 TC+CC基因型的rs17576隐形模型能够显著增加TAA的发病风险。在携带rs1927914 TC+CC基因型情况下,rs17576隐形模型能够显著增加主动脉瘤和AAA的发病风险(OR分别为2.333和2.519)。此外,随着风险基因型数量的增加能够显著增加主动脉瘤和AAA的发病风险(Ptrend分别为0.032和0.031)。3.TLR4、MMP9基因多态性与心血管危险因素交互作用与主动脉瘤发病风险的关联分析TLR4rs11536889 CC基因型与血脂异常存在交互作用并显著增加TAA的发病风险(Pinteraction=0.001)。TLR4rs1927914 CC基因型与高血压存在交互作用,能够显著增加总体主动脉瘤和AAA的发病风险(Pinteraction分别为0.018和0.039),糖尿病与TLR4rs1927914 CC基因型在增加主动脉瘤和TAA发病风险上存在交互作用(Pinteraction分别为0.032和0.018),与TC+CC基因型在增加AAA发病风险上存在交互作用(Pinteraction=0.040)。4.TLR4、MMP9血清及组织蛋白表达与主动脉瘤发病风险的关联分析在总体比较中,AAA和TAA血清TLR4和MMP9水平明显高于对照组。分层结果显示,除了对照组与TAA组在糖尿病分层中TLR4血清表达无显著差异外,在每个分层分析中AAA和TAA的TLR4血清表达均显著高于对照组(P<0.05)。在年龄<65岁、正常血糖和正常血脂亚组中,MMP9血清表达水平从对照组到AAA组到TAA组逐渐增高(P<0.05)。与对照组相比,无论是男性还是女性,AAA和TAA患者血清MMP9水平显著增高,而高血压患者MMP9水平也存在此差异(P<0.05)。此外,TLR4和MMP9在主动脉瘤组织中存在不同水平表达,而在正常主动脉组织中呈阴性表达,两组间TLR4和MMP9组织表达水平和阳性表达比例存在显著差异(P<0.001)。血清TLR4和MMP9蛋白表达水平显著正相关(r=0.412,P<0.001),TLR4和MMP9组织表达水平亦显著正相关(r=0.718,P<0.001)。5.血清TLR4、MMP9蛋白表达与主动脉瘤相关血清生物标志物和主动脉瘤最大直径的相关性血清TLR4与循环中CRP、D-二聚体、Fg、Hcy和Cys-c等生物标志物存在显著的相关性(P<0.05)。血清MMP9与CRP、D-二聚体和Hcy呈显著正相关(P<0.05)。但是,血清TLR4、MMP9表达水平与主动脉瘤最大直径无明显相关性(P>0.05)。6.血清TLR4和MMP9对主动脉瘤疾病的诊断和预测价值TLR4诊断AAA和TAA的最佳截点值分别为13.86 ng/ml和11.31 ng/m,对应的曲线下面积(AUC)分别为0.662和0.689,灵敏度分别为45.9%和57.7%,特异度为84.7%和72.1%。血清MMP9预测AAA和TAA的最佳截点值分别为385.32ng/ml和393.00 ng/m,对应的AUC分别为0.686和0.834,灵敏度分别为49.5%和69.6%,特异度分别为87.5%和91.1%。7.TLR4、MMP9基因多态性对TLR4、MMP9血清及组织蛋白表达的影响TLR4rs1927914多态与血清TLR4表达存在相关性,在总体人群和主动脉瘤患者中,杂合型(TC vs.TT)和显性模型(TC+CC vs.TT)携带者血清TLR4蛋白表达显著增高(P<0.05),而TLR4rs11536889和MMP9rs17576多态不影响TLR4和MMP9血清表达(P>0.05)。主动脉瘤组中TLR4、MMP9基因多态性与TLR4、MMP9组织蛋白表达之间无明显相关性。8.体外功能实验验证TLR4rs1927914对启动子活性的影响荧光素酶报告基因实验结果显示,携带TLR4rs1927914 C等位基因的启动子活性显著高于携带T等位基因的启动子活性(0.589±0.004 vs.0.340±0.014,P<0.001)。结论:1.单一多态研究结果提示,MMP9rs17576基因多态性与主动脉瘤和AAA的风险增加相关;TLR4rs1927914与增加男性主动脉瘤发病风险相关;MMP9rs17576与男性主动脉瘤及其亚型的发病风险增加有关,也与增加≤60岁人群患主动脉瘤和AAA的风险相关。2.SNP-SNP交互作用研究结果提示,TLR4rs1927914-MMP9rs17576在TAA发病中存在交互作用。TLR4rs1927914和MMP9rs17576在增加主动脉瘤和AAA发病风险中存在上位效应和累积效应。3.SNP-心血管危险因素交互作用结果提示,TLR4rs11536889与血脂异常在TAA发病中存在交互作用,TLR4rs1927914与高血压在主动脉瘤和AAA发病中存在交互作用,TLR4rs1927914与糖尿病在主动脉瘤及其亚型发病中存在交互作用。4.血清和组织蛋白TLR4和MMP9高表达与主动脉瘤发病风险相关,且血清TLR4和MMP9对主动脉瘤疾病具有重要的诊断和预测价值。5.TLR4rs1927914基因多态与血清TLR4蛋白表达存在相关性,TLR4rs1927914杂合型和显性模型携带者血清TLR4表达高于野生纯合型携带者。6.TLR4基因5’-UTR区的rs1927914多态可以改变启动子活性,进一步明晰了rs1927914增加主动脉瘤发病风险的可能机制。