不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino),原产中国大陆,是我国人民,尤其是南方群众喜食的主要蔬菜之一。近些年来,其产量和质量需求不断提高,但由于雄性不育品种较少且稳定性较差,不能充分利用杂种优势来获得优良种质,故获得优质的雄性不育系成为如今十分迫切的任务之一。雄蕊花瓣化,可以彻底消除不育系自身花粉的影响,具有良好的科研利用价值。本文在已获得的不结球白菜中稳定性较好的雄蕊瓣化系及其保持系作为研究试验材料,测定了 2种材料中的一些代谢生理指标,用分子标记法获得2种材料的差异片段并克隆出差异基因BcERF-B3的ORF全长,通过qRT-PCR的手段探究该基因在不同组织及器官中的表达,然后构建其过表达重组质粒,拟对该基因的功能进行转基因验证。另外,通过原核表达得到该基因的诱导蛋白,为下一步探究该基因作用的下游基因奠定基础。本文主要研究结果如下:1.形态观察及生理指标的测定本研究以实验室保存的不结球白菜雄蕊突变系和保持系为试验材料,进行花器官形态观测,并对花发育不同时期中2种材料SOD、POD及CAT活性、可溶性蛋白、可溶性糖和MDA含量进行测定。结果显示,与保持系中相比,突变系花器官中最明显的不同处在于其雄蕊完全缺失,而花瓣的数目则相应增加,雄蕊对应处的花瓣无花药,推断本研究中该雄蕊突变系可能属于花同源异型的突变类型;与保持系花发育过程中三种抗氧化酶活性和MDA含量相比,突变系在中后期显著升高;在花发育不同时期中,突变系的可溶性糖和可溶性蛋白含量低于保持系,且2者在发育中期存在显著差异。2.BcERF-B3基因的分子克隆及乙烯调控分析通过RT-PCR技术克隆出不同不结球白菜中差异基因,即乙烯响应因子(Ethylene-responsive factor,ERF 基因,命名为BcERF-B3,利用生物学软件进行序列分析。结果显示,不结球白菜BcERF-B3基因的ORF全长(807bp),编码268个氨基酸;RT-PCR分析发现,花期BcFRF-B3基因在花瓣、雄蕊及花柱中表达量均显著高于保持系;实时荧光定量PCR(qPCR)发现,BcERF-B3基因在突变系花发育中期表达量明显升高,且蕾期喷施乙烯(ET)能促进其表达,外施AgNO3抑制该基因表达。本研究表明BcERF-B3基因可能在花发育中期时响应内源ET而促进了雄蕊的发育异常。3.BcERF-B3基因在不结球白菜响应胁迫中的表达及其过表达质粒的构建为详细了解BcERF-B3基因在不结球白菜突变系和保持系中不同胁迫下的表达谱,分别取样进行qPCR。结果发现,突变系中BcERF-B3基因响应ABA、MeJA和低温胁迫,推测该基因可能受2种激素和低温诱导,调控花器官的发育异常;利用Gateway技术手段,构成35S::BcERF-B3的过表达重组质粒,并转化入根癌农杆菌,为深入探索不结球白菜BcERF-B3基因的功能及作用机理,进一步优化不结球白菜雄性不育品系奠定基础。4.不结球白菜BcERF-B3基因原核表达质粒的构建及原核表达将BcERF-B3 ORF全长片段定向插入原核表达载体pET30a中,并转化至宿主菌BL21(DE3)进行蛋白诱导,对诱导的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、温度条件进行优化,以期获得目的蛋白,为下一步的验证奠定基础。结果表明,pET30a-BcERF-B3成功导入宿主菌BL21(DE3)中;SDS-PAGE电泳结果显示,重组质粒表达出35.4KD的融合蛋白,与编码蛋白大小为29.6KD的预测结果一致,但条带较弱;对诱导表达条件的优化结果显示,融合蛋白pET30a-BcERF-B3最佳的诱导表达条件为1mmol/L的IPTG终浓度,37℃下诱导5h,并超声破碎细菌得到目的蛋白。