【摘 要】
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微小隐孢子虫是一种细胞内但非胞质内寄生的能够感染人和动物的寄生原虫。世界卫生组织于1986年将人隐孢子虫病确定为艾滋病怀疑指标之一。在抗隐孢子虫药物方面,目前仅硝唑尼特被美国食品药品监督管理局批准在免疫正常的人群使用,以及乳酸常山酮被欧盟批准兽用。因此,抗隐孢子虫的药物研发是迫切需要的。在针对细胞内病原体（例如,微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum,C.parvum））的药物
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2017YFC1601200）；
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微小隐孢子虫是一种细胞内但非胞质内寄生的能够感染人和动物的寄生原虫。世界卫生组织于1986年将人隐孢子虫病确定为艾滋病怀疑指标之一。在抗隐孢子虫药物方面,目前仅硝唑尼特被美国食品药品监督管理局批准在免疫正常的人群使用,以及乳酸常山酮被欧盟批准兽用。因此,抗隐孢子虫的药物研发是迫切需要的。在针对细胞内病原体（例如,微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum,C.parvum））的药物研发中,仍缺乏简单并有效的手段来确认抗病原体化合物的靶向作用,因为常规的体外试验无法区分化合物是作用在寄生虫药靶上还是作用在宿主细胞药靶上,或两者兼有。解决此问题的方法之一是比较化合物对药物耐受性增加的宿主细胞中培养的寄生虫的抗寄生虫效果,若抗寄生虫效果没有或很少变化则表明化合物作用于寄生虫的药物靶点。然而,产生耐药细胞通常是一个耗时的过程。因此,本研究建立了一种通过在HCT-8细胞中过表达人类多药耐药基因MDR1来快速生成耐药宿主细胞的新方法,以评估所选化合物对C.parvum的作用途径。我们首先使用瞬时转染模型,其中MDR1在HCT-8细胞中的过表达能够持续至少72小时,从而为评估C.parvum的药物疗效提供了充足的窗口期。在六种已知的抗隐孢子虫化合物中,MDR1的瞬时过表达显着增加HCT-8细胞对紫杉醇、阿霉素和长春新碱的耐药性（即增加至2.11-2.27倍）,但对环孢霉素A、柔红霉素和硝唑尼特的耐药性并没有增加。进一步的化合物抗隐孢子虫效果检测表明,宿主细胞耐药性的增加对紫杉醇的抗隐孢子虫效果没有影响,但会影响阿霉素的抗隐孢子虫效果。这些结果表明,在有效浓度下,紫杉醇主要作用于寄生虫药物靶点,而阿霉素同时作用于寄生虫和宿主细胞的药物靶点。然而,瞬时转染系统仅限于MDR1底物的抗隐孢子虫效果的作用途径的验证。为了克服这一限制,我们构建了一种稳定的转染系统（即MDR1转基因HCT-8细胞;或简称MDR1细胞）,该系统能够通过持续施加药物压力对MDR1的底物和非底物产生耐药性。使用稳定的转基因细胞,在相对较短的时间（三个月）内成功提高紫杉醇的耐药性（MDR1底物,与空白载体阴性对照相比增加到3.71倍）,并增加硝唑尼特的耐药性（非MDR1底物,增加到2.02倍）。使用这两种宿主细胞系,即MDR1（PTX）和MDR1（NTZ）细胞,我们证实了紫杉醇和硝唑尼特在体外的抗隐孢子虫效果的作用途径。此外,MDR1（PTX）细胞对其他化合物的耐药性也明显增加,包括米托蒽醌（相对于NC细胞增加到2.73倍）、阿霉素（增加到2.40倍）、长春新碱（增加到3.01倍）和伊维菌素（增加到2.38倍）,因此能够对这四种化合物的抗虫效果的作用途径进行验证。随后的实验表明,这四种化合物的抗隐孢子虫效果一部分归因于它们对隐孢子虫靶点的作用（即中靶效应）,而对宿主细胞靶点的作用（即脱靶效应）也有助于它们的抗隐孢子虫效果。综上所述,本研究建立了两种体外模型来评估抗隐孢子虫药物的作用途径（即药物的中靶效应）。第一个模型使用转染MDR1基因的HCT-8细胞,该模型适用于MDR1底物。第二个模型使用稳定的MDR1转基因HCT-8细胞,该模型适用于MDR1的底物和非底物。通过利用这些模型,我们已经证实紫杉醇和硝唑尼特是通过主要作用于寄生虫靶点从而抑制C.parvum的体外生长,而米托蒽醌、阿霉素、长春新碱和伊维菌素是通过同时作用于寄生虫和宿主细胞靶点来抑制C.parvum的体外生长。本研究首次阐明了经典药物硝唑尼特（唯一获得FDA批准的用于治疗人类隐孢子虫病的药物）的中靶效应。
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