软组织肉瘤(Soft tissue sarcoma,STS)是来源于结缔组织的一类罕见的、具有很强侵袭性和异质性的恶性肿瘤。软组织肉瘤具有50多种不同的亚型,软组织肉瘤发病约占成人恶性肿瘤发病的0.7%～0.8%,占儿童恶性肿瘤发病的5%～7%。软组织肉瘤病理类型复杂多样,且不同地区软组织肉瘤发病情况、常见的病理类型并不相同。而作者所在的河南地区软组织肉瘤发病特征分析未见报道。软组织肉瘤发病率低,但其恶性程度很高,局部快速浸润性生长,且易复发、易转移,发病原因和发生机制仍不十分清楚。若能阐明其发生机制,则能为软组织肉瘤有效的预防和治疗提供依据。流行病学调查显示软组织肉瘤发生具有基因易感性,在软组织肉瘤患者瘤组织中发现抑癌基因突变,例如神经纤维瘤蛋白1(Neurofibromin1,NF1)、p16Ink4a和PTEN。若抑癌基因突变,相应抑癌蛋白表达量改变,则其无法通过抑制细胞增殖、调控细胞周期相关的信号通路发挥抑癌作用,最终导致肿瘤发生。目前仅有文献研究抑癌蛋白p16Ink4a和PTEN在软组织肉瘤中的单一表达,未见单独研究NF1蛋白或同时分析这三个抑癌蛋白在软组织肉瘤中表达水平的报道。microRNAs(miRNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,miRNAs的失调与多种肿瘤的发生发展有关,其不仅作用于癌基因,亦可以作用于抑癌基因。研究显示NF1、p16Ink4a、PTEN这三个抑癌基因在疾病发生过程中受到一些miRNAs调控,但是在软组织肉瘤发生中这三个抑癌基因受到哪些miRNAs的调控仍未阐明。目的1.分析2006～2016年河南省肿瘤医院1624例软组织肉瘤的发病特征,为河南地区软组织肉瘤的防治与科研提供线索。2.以所占构成比最高的未分化多形性肉瘤(Undifferentiated pleomorphic sarcoma,UPS)为研究重点,探讨抑癌蛋白NF1、p16Ink4a、PTEN及其介导的信号通路关键因子在UPS中蛋白表达情况;筛选出在UPS中差异表达且调控这三个抑癌基因的miRNA,为软组织肉瘤的发生机制提供理论依据和思路。3.构建NF1/p16Ink4a/PTEN条件性基因敲除小鼠时空限制性UPS动物模型,验证NF1、p16Ink4a、PTEN在UPS发生中的作用,验证并分析相关miRNA在小鼠UPS中的表达,为软组织肉瘤发生发展和转移机制研究提供更为良好的实验平台。方法1.收集河南省肿瘤医院(郑州大学附属肿瘤医院)病案科2006年1月1日至2016年12月31日期间首次住院的软组织肉瘤患者电子病历基本信息,包括患者住院号、性别、年龄、出生日期、出生地、入院日期、出院日期、肿瘤部位、病理名称等,采用SPSS21.0软件对软组织肉瘤住院患者年龄、性别、病理类型、住院天数、出生地、发病部位等指标进行描述性统计分析,计算不同病理类型构成比。2.以构成比最高的UPS为研究重点,收集河南省肿瘤医院骨与软组织肿瘤科68例手术切除的UPS患者的瘤组织和瘤旁正常肌肉组织,免疫组化法检测NF1、p16Ink4a、PTEN这三个抑癌基因的蛋白表达水平,分析两个抑癌蛋白低表达和三个抑癌蛋白低表达的比例;同样采用免疫组化法检测UPS患者的瘤组织和瘤旁组织中这三个抑癌基因介导的信号通路中关键磷酸化蛋白p-Akt、p-inTOR、p-S6、p-Erk的表达水平,免疫荧光双染confocol检测CDK6和Cyclin D1的结合情况;此外采用microRNA测序的方法进行UPS瘤组织和瘤旁正常肌肉组织中microRNA差异表达谱分析,采用生物信息学方法筛选出调控NF1、p16Ink4a、PTEN且差异表达明显的microRNA,并采用qPCR验证其表达水平。3.采用 Cre/LoxP 原理,构建 NF1flox/flox-Ink4a/Arfflox/flox-PTENflox/flox 条件性基因敲除小鼠时空限制性软组织肉瘤模型,向小鼠左后肢肌肉中注射Cre腺病毒,待其自发形成软组织肉瘤,观察其成瘤潜伏期、数量和转移等情况,计算成瘤率;并采用免疫组化法检测小鼠软组织肉瘤和瘤旁组织中NF1、p16Ink4a、PTEN、p-Akt、p-mTOR、p-Erk和p-S6蛋白表达水平,采用免疫荧光双染confocol法检测CDK6和Cyclin D1的结合情况,采用qPCR法在动物模型中验证调控NF1、p16Ink4a、PTEN的相关miRNAs的表达水平。结果1.(1)2006～2016年河南省肿瘤医院软组织肉瘤住院患者共1624例,患者平均年龄为44.71±17.91岁。软组织肉瘤住院患者自15岁后明显增多,在40岁-60岁达到高峰,75岁以后迅速下降。(2)所占构成比最高的前九种软组织肉瘤病理类型为:未分化多形性肉瘤(23.83%)、滑膜肉瘤(16.69%)、脂肪肉瘤(13.67%)、纤维肉瘤(10.22%)、未报告明确类型的肉瘤(8.99%)、平滑肌肉瘤(7.02%)、隆突性皮肤纤维肉瘤(5.79%)、横纹肌肉瘤(4.68%)、恶性神经鞘瘤(4.25%),共占软组织肉瘤住院患者总人数的95.15%。(3)1624例软组织肉瘤住院患者中男性923例,女性701例,男女比为1.32:1。男性和女性最常见的前三位病理类型软组织肉瘤均为未分化多形性肉瘤、滑膜肉瘤和脂肪肉瘤。(4)河南省肿瘤医院软组织肉瘤前九位病理类型顺位变化:2016年与2006年相比,未分化多形性肉瘤(第1位)顺位未发生改变;脂肪肉瘤的顺位明显上升(从2006年的第4位上升到2016年的第2位);纤维肉瘤的顺位明显下降(从2006年的第3位下降到2016年的第5位)。(5)软组织肉瘤住院患者出生地为河南东部地区的患者最多,占软组织肉瘤住院患者总数的28.57%;河南中部地区次之,为24.57%;河南南部地区、北部地区和西部地区分布为21.12%、13.49%和10.34%。2.(1)在68例UPS瘤组织中,NF1蛋白表达阳性率为39.71%;p16Ink4a阳性率为55.88%,PTEN阳性率为10.29%;在瘤旁正常肌肉组织中,NF1、p16Ink4a和PTEN蛋白表达阳性率分别为70.59%、75.0%和94.12%。UPS瘤组织中NF1、p16Ink4a、PTEN蛋白表达阳性率与瘤旁正常肌肉组织相比均显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。此外,不同性别、不同年龄段UPS患者瘤组织中NF1、p16Inka PTEN蛋白阳性表达率之间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。68例UPS患者中,发现有4例患者瘤组织抑癌蛋白表达为NF1(-)p16Ink4a(-)PTEN(+)、4例患者为NF1(+)p16Ink4a(-)PTEN(-),所占比例均为5.88%;有14例患者瘤组织抑癌蛋白表达为NF1(-)p16Ink4a(+)PTEN(-),所占比例为20.59%;而有19例患者瘤组织中三个抑癌蛋白全部为低/无表达NF1(-)p16Ink4a(-)PTEN(-),占所有患者的27.94%。(2)UPS瘤组织中p-Akt、p-mTOR、p-S6、p-Erk阳性区域面积占总面积的比例(分别为(17.44±2.73)%、(18.32±1.90)%、(22.52±2.39)%和(14.25±1.55)%)均明显高于瘤旁正常肌肉组织(分别为(6.41±1.60)%、(7.25±1.74)%、(4.29±1.50)%和(5.69± 1.88)%),差异均具有统计学意义(P<0.05)。此外,瘤旁正常肌肉组织中未见CDK6和CyclinD1结合的阳性细胞,而UPS瘤组织中CDK6和CyclinD1结合的阳性细胞率为(19.50±3.66)%。(3)采用miRNA测序技术对UPS瘤组织和瘤旁正常肌肉组织中miRNA进行测序和分析,以瘤组织和瘤旁组织中均有50以上copy数、Flod值大于5且P<0.05作为筛选标准,得到125个显著表达差异的已知miRNA,其中82个miRNA在瘤组织中上调,43个miRNA在瘤组织中下调。通过Targetscan和miRanda两个软件进行靶基因预测,反向筛选出调控NF1、p16Ink4a和PTEN的miRNAs,并在68对UPS瘤组织和瘤旁正常肌肉组织中验证8个miRNA表达水平(调控 NF1:miR-127-3p、miR-199a-3p 和 miR-34a-5p;调控p16Ink4a:miR-503-5p 和 miR-497-5p;调控 PTEN:miR-21-3p、miR-378d 和 miR-378a-3p),qPCR验证结果显示miR-127-3p在UPS瘤组织和瘤旁组织中相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);miR-199a-3p、miR-503-5p 和 miR-21-3p 在 UPS 瘤组织中相对表达量为4.10±0.77、6.60±1.61和4.34±0.79,与瘤旁正常组织(分别为1.02±0.22、1.24±0.36 和 1.23±0.30)相比表达上调,miR-34a-5p、miR-497-5p、miR-378d 和 miR-378a-3p 在 UPS 瘤组织中相对表达量为 0.19±0.95、0.21±0.04、0.0041±0.0012和0.0054±0.0013,与与瘤旁正常组织相比(分别为1.31±0.38、1.17±0.30、1.74±0.65和1.91±0.86)相比表达下调,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.(1)45只 NF1flox/flox-Ink4a/Arfflox/flox-PTENflox/flox小鼠注射 Cre 腺病毒后,全部出现注射部位的软组织肉瘤,成瘤率为100%,成瘤潜伏期为(53.4±3.1)天,有3只小鼠出现肺转移癌。肉瘤组织经病理学鉴定全部是未分化多形性肉瘤。(2)小鼠形成的UPS瘤组织中抑癌蛋白NF1、p16Ink4a、PTEN均不表达,而在小鼠瘤旁正常肌肉组织中均阳性表达。小鼠UPS瘤组织中p-Akt、p-mTOR、p-S6、p-Erk阳性区域面积占总面积的比例(分别为(41.34±1.61)%、(24.27±3.89)%、(10.87±1.34)%和(10.56±2.50)%)均明显高于瘤旁正常肌肉组织(分别为(8.31±1.91)%、(7.64±1.88)%、(2.24±1.14)%和(2.61±1.21)%),差异均具有统计学意义(P<0.05);此外,小鼠瘤旁正常肌肉组织中未见CDK6和Cyclin D1结合的阳性细胞,小鼠UPS瘤组织中CDK6和Cyclin D1结合的阳性细胞率为(8.30±1.08)%。(3)qPCR法验证45例小鼠UPS瘤组织与瘤旁组织中8个调控这三个抑癌基因的miRNAs相对表达量,结果显示与瘤旁正常肌肉组织相比,小鼠UPS瘤组织中miR-127-3p、miR-199a-3p和miR-503-5p相对表达量均有升高的趋势,但是差异无统计学意义(P>0.05);miR-34a-5p、miR-497-5p、miR-21-3p、miR-378d和 miR-378a-3p 在小鼠 UPS 瘤组织相对表达量为 0.03±0.01、0.12±0.03、0.04±0.02、0.0093±0.0052 和 0.0040±0.0021,与小鼠瘤旁正常组织(1.55±0.60、1.13±0.38、1.47±0.47、1.22±0.31和1.49±0.50)相比表达下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论1.2006～2016年河南省肿瘤医院软组织肉瘤住院患者平均年龄为44.71±17.91岁,男女比例为1.32:1,所占构成比前三位的病理类型为未分化多形性肉瘤、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤,且从2006年至2016年未分化多形性肉瘤所占构成比均排在首位,这种病理类型软组织肉瘤应成为今后防治工作与科学研究的重点。2.抑癌蛋白NF1、p161nk4a、PTEN单一/共同低表达,以及其介导的Ras-Raf-Mek-Erk、PI3K-Akt-mTOR-S6 和 CDK6-Cyclin D1 信号通路激活与未分化多形性肉瘤发生有关;miRNA测序联合生物信息学筛选出了调控NF1、p16Ink4a、PTEN且差异表达显著的miRNA,经验证分别为无表达差异的miR-127-3p,表达上调的 miR-199a-3p、miR-503-5p 和 miR-21-3p,表达下调的miR-34a-5p、miR-497-5、miR-378d 和 miR-378a-3p。3.成功构建并优化了时空限制性软组织肉瘤小鼠模型。在动物模型中验证NF1/p161nk4a/PTEN及其介导的信号通路关键蛋白的表达水平,并验证了人群研究中筛选出的调控三个抑癌基因的miRNA,分别为无表达差异的miR-127-3p、miR-199a-3p和miR-503-5p,表达下调的 miR-21-3p、miR-34a-5p、miR-497-5、miR-378d 和 miR-378a-3p。