目的：　　验证先前构建的NSP486-175原核表达系统的有效性，大量制备蛋白；在已构建的pET-28a(+)-NSP486-175原核表达系统的基础上进一步构建pET-28a(+)-NSP486-175-EGFP重组表达系统并表达提纯该蛋白；研究 NSP486-175对大鼠胚胎心肌细胞 H9c2(2-1)的损伤作用及其可能的相关机制，有助于在细胞层面上为RV病毒肠道外致病的可能性及其相关机制提供一些理论依据。　　方法：　　1．提取pET-28a(+)-NSP486-175重组质粒，运用PCR和酶切鉴定的方法对重组质粒进行验证；用 IPTG诱导 pET-28a(+)空载体表达菌和 pET-28a(+)-NSP486-175重组质粒表达菌，采用SDS-PAGE和western blot分析蛋白表达情况；利用重力型Ni-NTA亲和层析纯化NSP486-175蛋白并采用离心式超滤管对其脱盐浓缩。　　2．扩增含pPG/miR/EGFP/Blasticidin和pET-28a(+)-NSP486-175质粒大肠杆菌BL21并提取相应的质粒， PCR扩增出 EGFP目的基因；对 EGFP基因和pET-28a(+)-NSP486-175质粒分别进行双酶切，T4 DNA连接酶连接并转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞；采用菌落PCR和质粒酶切鉴定重组菌的正确性。　　3．NSP486-175-EGFP融合蛋白的诱导表达和纯化　　初步对含有pET-28a(+)-NSP486?175-EGFP的E. coli BL21(DE3)进行诱导表达，分析目的蛋白表达情况；采用各种诱导时间和IPTG浓度对含有重组菌进行诱导表达，探索最佳IPTG浓度和诱导时间；大量诱导表达融合蛋白，SDS-PAGE分析蛋白的表达方式及表达量；运用Ni-NTA亲和层析纯化破菌后的上清蛋白，纯化蛋白用SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定。　　4．NSP486-175蛋白对心肌细胞损伤作用　　培养Caco-2细胞并用Fluo-3 AM标记[Ca2+]i，用纯化的NSP486-175作用于细胞，激光共聚焦显微镜检测NSP486-175对Caco-2细胞的[Ca2+]i的影响以验证蛋白活性；培养 H9c2(2-1)细胞，用不同浓度的纯化蛋白和对照（空载体表达菌纯化物或PBS）作用于心肌细胞，培养12h后，用倒置显微镜观察细胞的形态变化；用全自动生化分析仪检测各组的细胞培养液中LDH活性；将心肌细胞制备成单细胞层爬片，蛋白作用12 h后，用鬼笔环肽对心肌细胞的actin骨架蛋白染色，DAPI复染细胞核，再置于荧光显微镜下观察心肌细胞actin骨架结构的变化。　　5．NSP486-175蛋白对心肌细胞损伤作用的可能的机制　　用 Fluo-3 AM标记 H9c2(2-1)细胞的[Ca2+]i，激光共聚焦显微镜检测 NSP486?175对H9c2(2-1)细胞的[Ca2+]i的影响；心肌细胞负载Fluo-3 AM后，分别用Hanks液和D-hanks液孵育心肌细胞，激光共聚焦显微镜检测NSP486?175蛋白对[Ca2+]i的影响；心肌细胞负载Fluo-3 AM后，用PBS或U-73122（磷脂酶C抑制剂）处理心肌细胞后再用激光共聚焦显微镜检测NSP486?175蛋白对[Ca2+]i的影响；用CD49b（整合素α2）抗体阻断心肌细胞整合素α2受体，再用NSP486-175刺激细胞，检测细胞的[Ca2+]i和细胞状态变化情况；NSP486-175-EGFP融合蛋白与心肌细胞共同孵育，荧光显微镜观察蛋白与细胞结合情况；预先用维拉帕米处理细胞，在用NSP4刺激心肌细胞，观察细胞的生长状态。　　结果：　　1．PCR产物经电泳分析出现了大小为300bp左右的DNA片段，重组质粒经NcoⅠ、HindⅢ酶切获得的了大小约为300bp的DNA片段。SDS-PAGE分析pET-28a(+)-NSP486-175表达菌和空载体表达菌诱导后的表达产物，重组菌在分子量为11kD左右的位置出现了较浓的条带而空载体表达菌则没有出现相应条带，在目的表达菌破菌后的上清中能纯化出11kD左右的单一蛋白并能与抗His单克隆抗体结合，而空载体表达菌纯化物不含蛋白。　　2．pET-28a(+)-NSP486-175-EGFP原核表达质粒的构建　　以pET-28a(+)-NSP486-175-EGFP重组质粒为模板的PCR产物经电泳分析，在725bp左右的出现预期大小的条带，pET-28a(+)-NSP486-175-EGFP分别经XhoⅠ和HindⅢ双酶切也得到了与目的基因大小相符的条带。　　3．NSP486?175-EGFP诱导表达及纯化　　SDS-PAGE分析发现NSP486?175-EGFP蛋白大部分以包涵体方式存在，一部分为可溶性表达存在于上清中，相对分子质量约为38 kD，比NSP486-75分子量多大概27kD。NSP86?175-EGFP蛋白诱导最佳条件为37℃，0.5 mmol/L IPTG诱导7 h。Ni-NTA亲和层析纯化后的蛋白经Western blot鉴定在PVDF膜上的38 kD左右处有与抗His抗体结合的特异性条带。　　4． NSP486-175蛋白对心肌细胞损伤作用　　NSP486?175蛋白作用后，Caco-2细胞内荧光增强，时间-平均荧光强度曲线显示加蛋白后平均荧光强度瞬时升高，在35 s达到峰值，之后逐渐下降；背景值与加蛋白后荧光强度最大值的比较，t=6.228，P＜0.0001，差异有统计学意义；H9c2(2-1)细胞贴壁生长状态良好，呈典型的成肌样细胞形态，细胞呈梭形，边界清晰；经不同浓度的NSP486-175作用12 h后，细胞出现不同程度的病理改变，如细胞空泡变性，皱缩变圆，细胞碎裂、脱壁；蛋白处理组培养液中的LDH活性均升高；荧光显微镜下观察可见，空白对照组的心肌细胞内均匀分布有典型的actin肌动蛋白丝；蛋白作用后，典型的actin肌动蛋白丝减少了，而断裂的，聚集actin蛋白增多，有的甚至聚集成颗粒团块状分布于胞质边缘和中央。　　5．NSP486-175蛋白对心肌细胞损伤作用的可能的机制研究　　NSP486-175加入后心肌细胞内荧光强度逐渐变亮，随后逐渐下降,而对照组则无明显变化；时间-平均荧光强度变化曲线显示H9c2(2-1)细胞荧光强度30 s内达峰值，随后逐渐下降，呈一过性升高，而对照组则随着时间慢慢下降。经统计学分析，心肌细胞内的荧光峰强度与加蛋白前的背景强度相比，t=7.256，P＜0.0001具有显著性差异。细胞处于有无钙离子外环境中，NSP4均能引起心肌细胞内钙离子的显著升高，且升高模式相似，两者比较，t=1.505，P=0.1410，差异无统计学意义；U-73122（磷脂酶 C抑制剂）处理后，NSP4引起的钙离子升高的效应被显著阻断，出现轻微的升高后又逐渐下降，分别用终浓度为0μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl和4μg/μl的蛋白作用于细胞，细胞内钙离子浓度升高程度在一定范围内随着蛋白浓度的升高而提高。整合素α2受体经特异性抗体阻断后， NSP4仍能导致细胞内钙离子浓度轻微升高，但与PBS和非特异性抗体（抗-His抗体）处理组相比，钙离子升高的程度明显下降；阻断组分别与 PBS非阻断组和非特异性抗体阻断组比较，经统计学分析，结果分别为t=7.297，P＜0.0001和t=11.62，P＜0.0001，差异有统计学意义；对照组之间比较t=0.8703，P=0.3913，差异无统计学意义；整合素α2受体经特异性抗体阻断后，相较于PBS和非特异性抗体（抗-His抗体）处理组细胞，细胞病变效应显著减弱；NSP486-175-EGFP能与H9c2(2-1)细胞结合，这种结合能被整合素α2受体特异性抗体阻断。维拉帕米预处理心肌细胞后，NSP4对心肌细胞仍有损伤效应。　　结论：　　1． pET-28a(+)-NSP486-175重组质粒保存完好，表达系统能稳定高效表达NSP486-175蛋白，利用重力型 Ni-NTA亲和层析法制备出足量的具有生物活性的NSP486-175。　　2．构建了 NSP486?175-EGFP融合蛋白原核表达系统，对表达条件进行了优化并纯化出NSP486?175-EGFP蛋白。　　3．NSP486-175对心肌细胞具有细胞病变效应，能破坏心肌细胞 actin细胞骨架结构并能干扰细胞内钙离子平衡。　　4．NSP486-175主要依赖磷脂酶C途径导致心肌细胞内钙离子从细胞内钙库释放引起细胞质内钙离子浓度升高，且与蛋白浓度相关。　　5．NSP486-175能与心肌细胞结合且整合素α2是其主要受体，钙离子阻断剂（维拉帕米）对NSP4的细胞致病作用的阻断效应甚微。