论文部分内容阅读
目的：探讨透脓散提取液抗肿瘤作用及其可能的机制。方法：应用液相色谱-质谱联用技术测定透脓散总提物成分；MTT法检测不同浓度透脓散提物对不同肿瘤细胞(人淋巴瘤Raji细胞,人肠癌LOVO细胞)的增殖抑制率；流式细胞术检测透脓散提液对Raji细胞和LOVO细胞凋亡率及细胞周期的影响；RT-PCR检测透脓散提取液对Raji细胞和LOVO细胞PI3K/AKT信号通路相关分子(PI3K,Akt,m-TOR, p70S6K1,Bad,NF-KB,caspase9,caspase3)的mRNA的表达；Westernblot法检测透脓散提取液对Raji细胞和LOVO细胞PI3K/AKT信号通路相关分子(PI3K,p-Akt,p-mTOR,p-p70S6K1, p-Bad,NF-KB,caspase9,caspase3)蛋白表达的变化；急性毒性实验检测透脓散用药的安全性；根据荷肠癌LOVO细胞裸鼠移植瘤的体积和移植瘤重量计算透脓散提取液的抑瘤率；HE染色光镜观察肿瘤组织的形态结构。免疫组织化学法检测透脓散提取液对肿瘤组织P13K/AKT信号通路相关分子蛋白的表达：ELISA检测裸鼠血清Th1/Th2型细胞因子的含量。结果：1透脓散提取液主要的化学成分为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷,芒柄花苷洋,川芎内酯Ⅰ,毛蕊异黄酮,芒柄花黄素,黄芪甲苷,藁本内酯,且醇提液的成分明显高于水提液。2透脓散提取液可抑制Raji细胞和LOVO细胞的增殖活性并具有明显剂量和时间依赖性。对Raji细胞的72小时半数抑制率为(Half maximal inhibitory concentration,IC50)817.142μg/mL,对LOVO细胞的48小时IC50为：347.603μg/mL (258.526μg/mL to471.545μg/mL)。3透脓散提取液可诱导Raji细胞,LOVO细胞凋亡并阻滞细胞周期在G1期。125μg/mL,250μg/mL和500μg/mL透脓散提取液干预Raji细胞,48h后细胞的凋亡率分别为：12.23±1.98%(P<0.05),20.97+3.96%(P<0.01)和30.4±4.87%(P<0.01),与空白对照组6.02±1.01%相比具有显著的统计学意义。G1期的比例逐渐增高,分别为：44.80%±2.36%(P<0.05),55.48%+2.71%(P<0.01),66.76%±2.25%(P<0.01)与对照组39.66%±2.01%相比具有统计学意义。应用62.5μg/mL,125μg/mL,250μg/mL透脓散醇提液干预LOVO细胞48h后,LOVO细胞的凋亡率分别为：12.8%±1.58%(P<0.05),19.9%±2.16%,(P<0.01),29.57±2.76%(P<0.01)与对照组(7.3%±1.06%)相比具有显著的统计学意义。G1期细胞的比例逐渐增多,分别为：45.45%±2.54%(P<0.05),56.13%±2.54%(P<0.01),66.05%+2.54%(P<0.01)与对照组40.02%＋0.69%相比具有统计学意义。250μg/mL透脓散提取物干预Raji细胞48小时后明显降低Raji细胞NF-κB mRNA及蛋白的表达,增加Bad, caspase-9, caspase-3mRNA及蛋白的表达且具有明显的剂量依赖性。125μg/mL透脓散醇提液干预LOVO细胞48小时后明显降低PI3K, AKT, mTOR, p70s6kl mRNA表达,而Caspase-9,Caspase-3mRNA表达明显增加,PI3K, p-AKT, p-mTOR, p-p70s6kl蛋白表达降低,而Caspase-9, Caspase-3蛋白表达增加,同样具有明显的剂量依赖性。透脓散提取液最大给药量40000mg/kg时对裸鼠未见明显毒性。高、中、低剂量组的透脓散提取液抑瘤率分别为：67.11%、48.68%、36.84%。免疫组化显示透脓散组P13K,p-Akt, p-mTOR, p-P70S6K1, VEGF, CD31蛋白表达降低,caspase-9, caspase-3蛋白表达增加,且随着剂量的增高,作用逐渐增强。此外,透脓散能调节移植瘤裸鼠的免疫功能,上调Thl型细胞因子(IL-2,IL-12),下调Th2型细胞因子(IL-6,IL-10),从而纠正移植瘤裸鼠机体Thl/Th2漂移,且此效应具有明显的剂量依赖性。结论：1透脓散提取液可从基因转录和蛋白表达两个层面调控PI3K/AKT信号转导通路中多个分子的表达,从而发挥其抑制Raji细胞、LOVO细胞的增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞停滞在G1期的作用。2透脓散提取液可能通过调控PI3K/AKT信号转导通路中多个分子的表达、纠正移植瘤裸鼠的Th1/Th2漂移从而发挥抑制LOVO裸鼠移植瘤的生长的作用。3透脓散可作为一种有潜力治疗恶性肿瘤的经典方剂。