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临床医学发展至今,器官移植已经成为外科领域的研究重点,因此抗免疫排斥反应抗生素的研发应用水平需要进一步提高。霉酚酸(Mycophenolicacid,MPA)是短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)次级代谢分泌产生的一种抗生素,它具有抗真菌、抗肿瘤和免疫抑制的作用。霉酚酸对次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶具有可逆性抑制作用,并对淋巴细胞活性起到选择性抑制作用。它的2-乙基酯类衍生物——霉酚酸酯(Morpholinoethyl Ester of Mycophenolic Acid,MMF)是新一代免疫抑制剂,在器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗方面展示了广泛的应用空间和前景。作为合成霉酚酸酯的前体化合物,提高霉酚酸工业化发酵生产水平具有重要的研究意义。本文对短密青霉ATCC16024在液体环境发酵生产霉酚酸初始培养基配方和补料策略进行优化,通过对菌种合成霉酚酸代谢途径的定向遗传改造,提高工业菌种的生产性能,并对丝状菌的发酵放大规律进行研究。(1)短密青霉发酵生产霉酚酸初始培养基配方优化运用Plackett-Burman设计法和响应面分析法,优化霉酚酸初始发酵培养基组分,最终确定优化后的发酵培养基配方:葡萄糖93.43 g/L,甘氨酸13.36 g/L,KH2PO4 3 g/L,MgSO4·7H2O 2g/L,L-蛋氨酸0.5g/L,微量元素。在7L发酵罐中发酵验证,霉酚酸产量达到1.72 g/L,实现了响应面优化预期效果,比初始培养基发酵产量提高了63.8%。(2)组合补料策略提高短密青霉发酵生产霉酚酸的产量对短密青霉ATCC16024生产霉酚酸发酵策略进行了优化。在7L发酵罐中,在发酵120 h 后即霉酚酸生产合成期,分别设计 CN-feeding strategy(F-CN)、pH-controlled strategy(F-pH)、Met-feeding strategy(F-Met)策略并对相关参数进行了考察分析。实验结果显示,三种策略控制下霉酚酸产量分别达到2.23 g/L、1.92g/L和2.03g/L,比分批发酵实验分别提高了29.65%、11.63%、18.02%。在上述基础上,建立了一种组合补料策略(F-CPM)。发酵120h后,通过三种方式控制发酵过程:1)补加质量比C/N=7:1的葡萄糖-甘氨酸;2)控制pH维持在6.5;3)补加蛋氨酸,使其浓度达到1.0 g/L。在本组合补料策略控制下,发酵240h时菌体最大干重(DCWmax)达到45.77g/L,312h时霉酚酸最大产量(Pmax)达到2.68 g/L,比分批发酵提高了55.81%。(3)透明颤菌血红蛋白基因在短密青霉菌中的克隆转化与表达通过根癌农杆菌LBA4404介导转化,编码透明颤菌血红蛋白的结构基因(Vitreoscilla Hemoglobingene,vgb)在短密青霉ATCC16024中克隆,从而表达透明颤菌血红蛋白(VHb),有效的改善菌体对氧的摄取能力,提高了霉酚酸的发酵产量。通过潮霉素(Hygromycin B)抗性筛选、基因鉴定和7L反应器中发酵验证得出,vgb基因在短密青霉中成功获得了克隆;VHb的表达提高了短密青霉的菌体密度,转化子霉酚酸产量达到2.18 g/L,比初始菌株提高了 27.5%。(4)短密青霉HMG-CoA裂解酶基因插入失活提高霉酚酸发酵产量运用巢式PCR和基因步移技术,首次获得了霉酚酸途径中的一个关键酶HMG-CoA裂解酶的全酶基因序列。同时设计对应简并引物获得了霉酚酸生物合成途径中其余4个关键酶的基因片段序列。利用根癌农杆菌LBA4404转化系统(ATMT),将HMG-CoA裂解酶基因进行了定向插入失活。潮霉素抗性筛选、基因鉴定等结果表明:HMG-CoA裂解酶基因定向敲除成功,霉酚酸产量达到2.94 g/L,较初始菌株提高了70.9%。ATMT转化系统在短密青霉发酵生产霉酚酸的遗传改造,为该菌通过基因工程方法提高霉酚酸发酵水平提供了强有力的工具。本课题阐述了提高短密青霉发酵生产霉酚酸产量的一系列方法。通过设计基于碳氮源配比分段式流加发酵策略,对于碳氮源的配比在菌体生长和霉酚酸生产阶段进行优化。深入探索霉酚酸合成代谢机理、发酵调控机理,跟踪菌丝形态、发酵液颜色、溶氧等参数,优化霉酚酸发酵策略。开展基于代谢工程技术的代谢网络关键酶研究,采用巢式PCR和基因步移等技术手段分析霉酚酸合成途径中基因簇和关键酶基因,通过对代谢途径中关键酶进行基因水平研究,进而对霉酚酸的发酵生产进行调控。