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结直肠癌是人类主要恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位居所有肿瘤的第三位和第二位。其中复发和转移是导致患者死亡的主要原因，因此尽早检测到患者复发转移并进行临床干预在临床上具有重要意义。ctDNA（循环肿瘤DNA）是由凋亡、坏死的肿瘤细胞释放出片段化DNA进入血液所形成，其携带有与肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，被认为是新一代肿瘤分子标志物。基于ctDNA检测的肿瘤“液体活检”不仅可进行拷贝数分析、单核苷酸变异及表观遗传改变的检测，还可实现对肿瘤患者进行无创、实时、动态监测。目前主要通过ddPCR、高通量测序等方法检测ctDNA从而实现对结直肠癌患者的术后评估和复发转移监测等，但ddPCR由于获取突变信息有限、操作过程繁琐且通量低，而高通量测序检测周期长、费用高且需要专业的生物信息学分析等原因限制了ddPCR和高通量测序在临床上的应用。因此，建立一种快速、简便、准确且成本低的ctDNA检测方法并将其推广至临床至关重要。
研究目的：
1.通过靶向高通量测序（532基因Panel）系统性分析结直肠癌复发和未复发患者组织中的单核苷酸变异、拷贝数改变和结构变异。
2.通过靶向高通量测序（532基因Panel）检测ctDNA评估结直肠癌患者复发。
3.建立一种快速、简便、准确且低成本的甲基化特异性qPCR（qMSP）用于评估结直肠癌患者复发，并初步比较甲基化特异性qPCR和高通量测序评估患者复发的潜能。
研究方法：
1.入组患者：本研究选取随访时间长达3年以上，且随访期间收集到患者术前血、手术组织、术后血、随访血以及临床信息的结直肠癌患者，并将患者分为复发组和3年以上未复发组进行后续研究。
2.靶向高通量测序：采用KAPA LTP Library Preparation Kit对复发患者和未复发患者组织DNA进行文库构建和IDT lotus Library Kit对复发患者的术前、术后、以及复发血浆的cfDNA进行双端UMI文库构建，继而使用IDT Pan-cancer532基因的靶向Panel进行捕获，然后进行HiseqX Ten高通量测序。
3.系统性分析复发和未复发患者组织中单核苷酸变异、拷贝数改变（CNVkit）和结构变异（Smoove软件）间的差异。
4.通过靶向Panel高通量测序检测复发患者术前、术后以及复发时的ctDNA，以评估结直肠癌患者复发。
5.甲基化特异性qPCR检测ctDNA：通过查找结直肠癌相关的甲基化Marker，并对这些基因的启动子区CpG岛进行分析并筛选结直肠癌特异的甲基化位点，最终建立用于检测结直肠癌ctDNA并评估其复发情况的甲基化特异性qPCR。
6.使用建立的甲基化特异性qPCR对86位结直肠癌患者的术前血进行检测，并对77位术前血ctDNA阳性患者的术后血及随访血进行检测并与高通量测序结果进行比较，以评估该qPCR assay检出结直肠癌患者的能力及评估复发转移的准确性。
研究结果：
1.通过对24位复发和24位未复发患者组织靶向测序数据进行分析发现：①复发患者相较于未复发患者基因组DNA存在更多的突变，包括更多的非同义突变、无义突变以及有害性突变；②复发患者中发生KRAS基因突变的比例明显高于未复发患者；③复发患者的原发灶与复发转移灶之间的突变具有高度的一致性。此外，复发转移灶与原发灶相比具有更多新发亚克隆突变；④以APC、TP53、KRAS为基础的基因加一小部分重要的致病突变位点，可以覆盖95%以上的患者，因此后续可以建立一个小Panel，不仅可覆盖到大部分患者，还可降低测序成本。
2.对48位结直肠癌患者进行拷贝数变异分析，发现复发患者和未复发患者在拷贝数变化上并无明显差异，提示拷贝数变异可能并不是造成患者复发的主要原因。此外，发现无论是复发还是未复发患者其拷贝数扩增均主要集中在染色体20q、13q、8q上，而缺失主要集中在染色体18q、8p、4q上。
3.对48位结直肠癌患者进行结构变异分析，仅在一位复发患者中发现CTNNB1基因3号外显子的缺失，该基因缺失可能是导致患者复发转移的一个重要影响因素，与文献中报道一致。
4.结合组织突变数据，对8位复发患者的术前、术后及复发时的血浆ctDNA靶向高通量测序数据进行系统性分析（平均测序深度约15000×），发现虽然该532基因Panel几乎涵盖了所有常见的肿瘤基因突变和热点突变区域，但仍然有4位患者在其复发时都未检到ctDNA，其在复发评估中相较于传统方法并未体现出明显优势。出现该结果的原因可能是由于复发患者病例数较少和测序深度不够所致，此外也可能是由于个别患者本身并未释放足够ctDNA至外周血所致。
5.本研究建立的甲基化特异性qPCR方法在结直肠癌术前血检出的灵敏度高达85%，基于此对入组的77位结直肠癌患者进行动态的ctDNA检测，其中20位复发的结直肠癌患者中有14位在复发前检测到ctDNA，比传统影像学平均提早5.9个月提示复发，而剩余6位未检测到ctDNA的患者可能是由于最后一次血样采集点离复发时间较远（距离时长平均为14个月，范围：7-22个月）而导致的阴性结果。该方法在诊断结直肠癌和预测患者复发的灵敏度要远高于CEA，但该方法目前仍存在一定的“假阳性”，后续研究中需要进一步提高检测的特异性。
6.对比8个复发患者的ctDNA检测结果，本研究所建立的甲基化特异性qPCR相比高通量测序检测ctDNA具有更高的灵敏度，且该方法具有操作简便、耗时短且成本低的优势。
研究结论：
1.比较结直肠癌患者的组织靶向测序数据，发现复发患者存在更多的无义突变和非同义突变，这可能是导致患者复发的一个影响因素。此外，KRAS突变和CTNNB1缺失也是影响肿瘤复发转移的重要因素，但拷贝数变异可能并不是造成患者复发的主要原因。
2.基于靶向测序数据，后续可以建立一个小Panel，该Panel可覆盖95%以上的结直肠癌患者，还可在降低测序成本的基础上达到较高的测序深度。
3.本研究中靶向Panel深度测序在评估患者复发时并未体现出明显优势，其检测成本高，周期长且需专业的生信分析等因素，使其难以真正应用至临床。
4.本研究建立了一种操作简便、耗时短且成本低的甲基化特异性qPCR用于检测结直肠癌患者ctDNA并评估复发转移，相较于靶向Panel高通量测序该方法具有更高的灵敏度，为ctDNA应用于临床提供了参考依据。
研究目的：
1.通过靶向高通量测序（532基因Panel）系统性分析结直肠癌复发和未复发患者组织中的单核苷酸变异、拷贝数改变和结构变异。
2.通过靶向高通量测序（532基因Panel）检测ctDNA评估结直肠癌患者复发。
3.建立一种快速、简便、准确且低成本的甲基化特异性qPCR（qMSP）用于评估结直肠癌患者复发，并初步比较甲基化特异性qPCR和高通量测序评估患者复发的潜能。
研究方法：
1.入组患者：本研究选取随访时间长达3年以上，且随访期间收集到患者术前血、手术组织、术后血、随访血以及临床信息的结直肠癌患者，并将患者分为复发组和3年以上未复发组进行后续研究。
2.靶向高通量测序：采用KAPA LTP Library Preparation Kit对复发患者和未复发患者组织DNA进行文库构建和IDT lotus Library Kit对复发患者的术前、术后、以及复发血浆的cfDNA进行双端UMI文库构建，继而使用IDT Pan-cancer532基因的靶向Panel进行捕获，然后进行HiseqX Ten高通量测序。
3.系统性分析复发和未复发患者组织中单核苷酸变异、拷贝数改变（CNVkit）和结构变异（Smoove软件）间的差异。
4.通过靶向Panel高通量测序检测复发患者术前、术后以及复发时的ctDNA，以评估结直肠癌患者复发。
5.甲基化特异性qPCR检测ctDNA：通过查找结直肠癌相关的甲基化Marker，并对这些基因的启动子区CpG岛进行分析并筛选结直肠癌特异的甲基化位点，最终建立用于检测结直肠癌ctDNA并评估其复发情况的甲基化特异性qPCR。
6.使用建立的甲基化特异性qPCR对86位结直肠癌患者的术前血进行检测，并对77位术前血ctDNA阳性患者的术后血及随访血进行检测并与高通量测序结果进行比较，以评估该qPCR assay检出结直肠癌患者的能力及评估复发转移的准确性。
研究结果：
1.通过对24位复发和24位未复发患者组织靶向测序数据进行分析发现：①复发患者相较于未复发患者基因组DNA存在更多的突变，包括更多的非同义突变、无义突变以及有害性突变；②复发患者中发生KRAS基因突变的比例明显高于未复发患者；③复发患者的原发灶与复发转移灶之间的突变具有高度的一致性。此外，复发转移灶与原发灶相比具有更多新发亚克隆突变；④以APC、TP53、KRAS为基础的基因加一小部分重要的致病突变位点，可以覆盖95%以上的患者，因此后续可以建立一个小Panel，不仅可覆盖到大部分患者，还可降低测序成本。
2.对48位结直肠癌患者进行拷贝数变异分析，发现复发患者和未复发患者在拷贝数变化上并无明显差异，提示拷贝数变异可能并不是造成患者复发的主要原因。此外，发现无论是复发还是未复发患者其拷贝数扩增均主要集中在染色体20q、13q、8q上，而缺失主要集中在染色体18q、8p、4q上。
3.对48位结直肠癌患者进行结构变异分析，仅在一位复发患者中发现CTNNB1基因3号外显子的缺失，该基因缺失可能是导致患者复发转移的一个重要影响因素，与文献中报道一致。
4.结合组织突变数据，对8位复发患者的术前、术后及复发时的血浆ctDNA靶向高通量测序数据进行系统性分析（平均测序深度约15000×），发现虽然该532基因Panel几乎涵盖了所有常见的肿瘤基因突变和热点突变区域，但仍然有4位患者在其复发时都未检到ctDNA，其在复发评估中相较于传统方法并未体现出明显优势。出现该结果的原因可能是由于复发患者病例数较少和测序深度不够所致，此外也可能是由于个别患者本身并未释放足够ctDNA至外周血所致。
5.本研究建立的甲基化特异性qPCR方法在结直肠癌术前血检出的灵敏度高达85%，基于此对入组的77位结直肠癌患者进行动态的ctDNA检测，其中20位复发的结直肠癌患者中有14位在复发前检测到ctDNA，比传统影像学平均提早5.9个月提示复发，而剩余6位未检测到ctDNA的患者可能是由于最后一次血样采集点离复发时间较远（距离时长平均为14个月，范围：7-22个月）而导致的阴性结果。该方法在诊断结直肠癌和预测患者复发的灵敏度要远高于CEA，但该方法目前仍存在一定的“假阳性”，后续研究中需要进一步提高检测的特异性。
6.对比8个复发患者的ctDNA检测结果，本研究所建立的甲基化特异性qPCR相比高通量测序检测ctDNA具有更高的灵敏度，且该方法具有操作简便、耗时短且成本低的优势。
研究结论：
1.比较结直肠癌患者的组织靶向测序数据，发现复发患者存在更多的无义突变和非同义突变，这可能是导致患者复发的一个影响因素。此外，KRAS突变和CTNNB1缺失也是影响肿瘤复发转移的重要因素，但拷贝数变异可能并不是造成患者复发的主要原因。
2.基于靶向测序数据，后续可以建立一个小Panel，该Panel可覆盖95%以上的结直肠癌患者，还可在降低测序成本的基础上达到较高的测序深度。
3.本研究中靶向Panel深度测序在评估患者复发时并未体现出明显优势，其检测成本高，周期长且需专业的生信分析等因素，使其难以真正应用至临床。
4.本研究建立了一种操作简便、耗时短且成本低的甲基化特异性qPCR用于检测结直肠癌患者ctDNA并评估复发转移，相较于靶向Panel高通量测序该方法具有更高的灵敏度，为ctDNA应用于临床提供了参考依据。