论文部分内容阅读
目的:肿瘤的侵袭转移是阻碍癌症治疗的最大挑战,也是导致胰腺癌(PC)致死率居高不下的主要原因。明确癌症侵袭转移发生时的内在机制可以为其治疗提供新的靶点。前期对同源但侵袭转移能力完全不同的两种胰腺癌细胞系(PC-1.0 vs PC-1)行分泌蛋白组学差异分析,并对差异蛋白进行验证,结果发现同线蛋白(SDCBP)在高侵袭转移的胰腺癌细胞(PC-1.0)中显著高表达。SDCBP是一种成熟的Syndecan结合蛋白,在多种癌症中表达均显著升高,且和肿瘤转移紧密相关,但其在PC中的作用仍未可知。本研究旨在探讨SDCBP在PC中的作用及其分子调控机制,为PC治疗提供新的靶点。研究方法:1、前期研究中,对同源但侵袭转移能力完全不同胰腺癌细胞(PC-1.0 vs PC-1)上清液进行了蛋白组学分析,鉴别了 161个表达倍数大于等于1.5倍的差异表达蛋白(DEPs)。为进一步阐明这些DEPs在胰腺癌中的作用,通过多种测序数据库验证DEPs在胰腺癌中的表达;通过生存分析、单因素Cox分析、多因素Cox分析验证DEPs对预后的影响。2、通过免疫组化、Western blot、RT-qPCR实验,验证了 SDCBP在PC中的表达;通过生存分析验证SDCBP对预后的影响;通过单因素Cox分析、多因素Cox分析探究了 SDCBP与临床病理参数的关系。3、分别构建SDCBP敲减慢病毒及过表达质粒,通过CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验检测SDCBP敲减或过表达后细胞增殖、克隆形成能力、癌细胞侵袭能力和迁移能力的变化;根据生信预测结果,通过Western blot实验探究SDCBP与PI3K/AKT通路及上皮间质转化(EMT)的关系。4、通过TargetScan、miRNet数据库预测能够调控SDCBP表达的microRNA(miRNAs);通过TCGA数据库验证miRNAs在PC中的表达;共表达分析验证miRNAs和SDCBP的相关性。进一步,在PC组织中验证miR-216b的表达,及其与SDCBP的相关性。TargetScan数据库预测miR-216b和SDCBP的结合位点,构建SDCBP野生型和突变型质粒,通过双荧光素酶实验验证miR-216b和SDCBP是否能够直接结合。5、构建miR-216b模拟物(agomiR-216b)和抑制剂(antagomiR-216b)并转染,通过CCK8实验、克隆实验、Transwell实验、划痕实验分别检测细胞增殖,克隆形成,侵袭和迁移能力的变化;Western blot检测PI3K/AKT通路和EMT相关蛋白的变化。在SDCBP敲减的稳转细胞中同时转染antagomiR-216b,采用上述实验检测增殖,侵袭,迁移,PI3K/AKT通路和EMT的变化。6、通过裸鼠皮下成瘤实验观察miR-216b和SDCBP对肿瘤生长的影响,以及两者对皮下移植瘤形成的作用及两者的调控关系。结果:1、通过 TCGAPAAD、GSE62165、GSE15471 数据库的验证,共有 21 个 DEPs在胰腺癌中存在高表达。通过单因素Cox分析和多因素Cox分析,发现仅有3个DEPs与胰腺癌预后相关。其中SDCBP高表达患者预后较差。SDCBP是PC预后的独立危险因素,单因素Cox风险比(HR)为1.349,置信区间为1.15-1.58;多因素Cox风险比为1.763,置信区间为1.19-2.61。GSEA功能富集分析进一步发现,SDCBP与细胞黏附、细胞外基质等过程相关,较常富集在Jak/STAT和PI3K/Akt等通路中。2、对61对PC组织行免疫组化染色,SDCBP在PC中的表达显著高于正常胰腺组织(67.2%vs 29.5%,p<0.05)。SDCBP高表达与患者不良预后相关,与更晚的TNM分期相关,是胰腺癌预后的危险因素。单因素Cox分析的HR和95%CI为2.379(1.486-4.348),p<0.001;多因素中分析的 HR 和 95%CI 为 2.177(1.294-3.475),p<0.001,表明SDCBP是胰腺癌预后的独立危险预测因子。3、SDCBP在PC细胞中的表达显著高于正常胰腺细胞。在高表达PC细胞中敲减SDCBP,能够显著抑制癌细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移的能力。在低表达PC细胞中过表达SDCBP,显著促进癌细胞的增殖,侵袭和迁移。敲减SDCBP后,细胞磷酸化PI3K、磷酸化AKT、N-cadherin蛋白的表达显著下降,E-cadherin的表达显著升高,PI3K和AKT的表达未见变化。这些结果表明,SDCBP通过PI3K/AKT通路诱导胰腺癌上皮间质转化(EMT)的发生,进而调控PC的增殖,侵袭和迁移。4、通过TargetScan、miRNet数据库预测及TCGAPAAD数据库验证,共有3个miRNAs能够作用于SDCBP。共表达分析显示,miR-216b和SDCBP表达呈显著的负相关(R=-0.34),p<0.001。miR-216b在TCGAPAAD数据库中显著低表达,低表达miR-216b和胰腺癌的不良预后相关(p=0.016)。进一步在PC组织中验证miR-216b的表达。miR-216b在PC组织和细胞中均存在相对低表达。miR-216b与SDCBP的表达成显著性负相关,相关系数为-0.50,p=0.009。TargetScan数据库预测miR-216b与SDCBP的结合位点。通过双荧光素酶实验,结果表明,miR-216b过表达能够降低野生型SDCBP的荧光素酶活性,而SDCBP突变后则无此变化。同时WB结果表明,miR-216b能显著抑制SDCBP蛋白的表达。5、在 PC 细胞中转染 miR-216b 模拟物(agomiR-216b)和抑制剂(antagomiR-216b)。结果表明,转染agomiR-216b后显著抑制癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力;转染antagomiR-216b能够显著促进癌细胞增殖、侵袭和迁移。在PC细胞中共转染antagomiR-216b和SDCBP敲减能够抵消抑制剂对癌细胞增殖,侵袭,迁移的促进作用。WB结果表明,agomiR-216b转染能够降低磷酸化PI3K、磷酸化AKT、N-cadherin蛋白的表达,增高E-cadherin的表达,并不改变PI3K和AKT的表达。转染antagomiR-216b的效应则与之相反。将antagomiR-216b与SDCBP敲减共转染能够回复miR-216b抑制剂对PI3K/AKT和EMT通路蛋白的作用。表明miR-216b能够作用于SDCBP,通过PI3K/AKT通路诱导EMT的发生,从而调控PC增殖,侵袭和迁移。6、在裸鼠中转染antagomiR-216b和agomiR-216b后,皮下肿瘤的体积和重量分别显著增加和下降;而在SDCBP敲除后,转染antagomiR-216b对肿瘤生长的促进作用能够被抵消,表明miR-216b能够通过靶向SDCBP,从而影响肿瘤的大小。结论:1、SDCBP在胰腺癌中广泛存在高表达,高表达的SDCBP和患胰腺癌者的不良预后显著相关,和更晚的TNM分期相关,是胰腺癌预后的独立危险因素。富集分析表明,SDCBP可能与EMT和PI3K/Akt通路相关。2、沉默SDCBP能够抑制PC细胞的增殖,迁移和侵袭,而过表达SDCBP可以促进癌细胞增殖,迁移和侵袭。SDCBP能够活化磷酸化PI3K和AKT的表达,影响N cadherin和E cadherin的表达,诱导胰腺癌EMT的发生。表明SDCBP通过PI3K/AKT通路诱导EMT的发生,进而促进胰腺癌的增殖,侵袭和迁移。3、miR-216b与SDCBP表达呈负相关,并可以与其3’-UTR的序列结合,调控其表达。作为抑癌miRNA,miR-216b过表达可以抑制PC的增殖,侵袭和迁移,通过抑制PI3K/AKT通路抑制EMT的发生;miR-216b干扰能够促进PC的进展,通过PI3K/AKT通路诱导EMT的发生,而敲减SDCBP,能够回复antagomiR-216b对PC的促进作用。4、裸鼠移植瘤的体积和重量随miR-216b的干扰和过表达而发生相应的增加或减小,沉默SDCBP能够抵消antagomiR-216b对移植瘤的促进作用。由此表明miR-216b能够直接作用于SDCBP,通过调控PI3K/AKT通路,诱导胰腺癌发生EMT,促进癌细胞增殖,侵袭和迁移。