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[目的] 本研究在前期有关体质的文献、临床和实验研究的基础上,通过观察中医寒、热体质大鼠的整体行为及神经-内分泌激素水平,来了解与体质代谢相关的主要指标差异。探讨引起寒、热体质大鼠热痛阈差异的分子机制。利用代谢组学技术,掌握寒、热体质大鼠尿液中与代谢相关的物质谱图,找到能区分相关体质的差异性代谢物。观察中药复方对寒、热体质的调整作用,探讨中药复方对寒、热体质大鼠生物学特征的影响。 [方法] 1.测定掌温结合大鼠的自主活动、一般情况,从自然大鼠群体中筛选出常体、热体及寒体体质大鼠。利用光辐射热甩尾法测定常体、热体及寒体大鼠热痛阈。对三组大鼠的掌温和热痛阈做相关性分析。 2.ELISA法对常体、热体及寒体大鼠血清多巴胺-β-羟化酶(Dopamin-β-hydroxylase,DBH)、皮质酮(Corticosterone,CORT)、睾酮(Testosterone,T)、三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)及甲状腺素(Thyroxine,T4)浓度进行检测。 3.实时荧光定量PCR(SYBRGreenⅠ)法及蛋白质印迹法(Westernblotting)检测常体、热体及寒体大鼠的大脑皮质TRPV1、TRPV4通道表达。 4.运用GC/MS对常体、热体及寒体大鼠的尿液进行检测,比较三种体质大鼠尿液代谢谱图的差异,并使用主成分分析(Principalcomponentanalysis,PCA)、偏最小二乘法判别分析法(Partialleastsquare-discriminantanalysis,PLS-DA)及正交偏最小方差判别分析法(Orthogonalpartialleastvariancediscriminantanalysis,OPLS)对数据进行挖掘。 5.观察寒体、热体大鼠分别服用金匮肾气丸和知柏地黄丸三个月后,热痛阈、DBH、大脑皮质TRPV1、TRPV4通道表达及尿液代谢物质谱图的变化。 [结果] 1.热体组大鼠热痛阈显著低于常体组及寒体组大鼠。寒、热体质大鼠掌温和热痛阈之间呈现显著性负相关,即掌温越高则热痛阈越低。 2.热体组大鼠血清DBH水平显著高于寒体组大鼠。热体组大鼠血清CORT、T和T3水平均有高于寒体组大鼠的趋势。 3.热体组大鼠大脑皮质TRPV1通道mRNA及蛋白表达显著高于寒体组大鼠;热体组大鼠大脑皮质TRPV4蛋白表达量高于寒体组大鼠。 4.常体组、热体组及寒体组大鼠尿样在PCA及PLS-DA图上有分离趋势但不能完全分开,而在OPLS图上常体组与寒体组、常体组与热体组、热体组及寒体组之间可以获得满意的区分效果,并可同时显示三组尿液代谢物差异。通过常体组与热体组比较,共有23个最终差异代谢物。通过常体组与寒体组比较,共有13个最终差异代谢物。经过鉴别,这些物质主要包括糖类、氨基酸、有机酸、维生素及脂肪酸等。热体组、寒体组与常体组相比,存在不同的差异代谢通路,主要与机体的能量代谢等有关。 5.寒、热体质大鼠在中药调整体质三个月后,血清DBH水平、热痛阈、大脑皮质TRPV1、TRPV4表达显著性差异均消失。在PCA图上完全不能区分给药后的常体组、热体组及寒体组。在OPLS图上给药后的常体组与寒体组、常体组与热体组之间可以获得满意的区分效果;但给药后热体组与寒体组无法区分,也无法同时区分给药后的常体、寒体和热体大鼠。三组在给药前后,各自的代谢轮廓存在明显差异。给药前后的三组之间,差异代谢物也不同。给药后的热体组与常体组、寒体组与常体组间与能量代谢相关的代谢通路均无显著性差异。 [结论] 1.寒、热体质大鼠DBH、热痛阈存在显著性差异,热体组大鼠血清CORT、T和T3水平均有高于寒体组大鼠的趋势。 2.大脑皮质的TRPV1、TRPV4通道表达差异可能是寒、热体质大鼠热痛感知差异、进而产生机体不同外在表征的分子生物学基础之一。 3.在PCA、PLS-DA图上能部分区分常体组、热体组及寒体组大鼠,而在OPLS图上常体组与寒体组、常体组与热体组、热体组及寒体组之间可以获得满意的区分效果,并可同时显示常体、寒体和热体大鼠的尿液代谢物差异。热体组、寒体组与常体组相比,存在不同的最终差异代谢物和差异代谢通路,主要与机体的能量代谢等有关。 4.寒、热体质大鼠分别在金匮肾气丸和知柏地黄丸调整体质三个月后,DBH、热痛阈与大脑皮质TRPV1、TRPV4表达的显著性差异均消失。在PCA图上完全不能区分大鼠给药后的常体组、热体组及寒体组。在OPLS图上无法同时区分给药后的常体、寒体和热体大鼠。说明调质中药的使用,使原存在于大鼠寒、热体质组间的尿液代谢差异减小。给药后的热体组与常体组、寒体组与常体组间差异代谢物及与能量代谢相关的代谢通路均无显著性差异,表明知柏地黄丸对热体组大鼠、金匮肾气丸对寒体大鼠整体的代谢通路起到了一定的调节作用,使之往正常水平变化。