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骨形态发生蛋白-7(bonemorphogeneticprotein-7,BMP-7)是一种有较强活性的生物因子,具有强大的诱导骨组织形成和抗肾纤维化作用,临床上已将rhBMP-7用于骨缺损的修复。
目前获取rhBMP-7的主要途径是利用原核表达系统,但它有些不利方面,如菌种易于产生退化、产生无活性的包涵体。对于退化菌种,需要对其复壮;包涵体蛋白质的复性也是基因工程制药的关键步骤,获得高复性率工艺一直是各个实验室追求的目标。对rhBMP-7的肾脏治疗作用,必须以可溶性注射制剂的形式给药,其内毒素含量需控制在药典规定的注射制剂限值以下。去除内毒素的方法很多,其中廉价、方便、蛋白损失较少的方法是离子交换色谱法。本实验采用阴离子色谱法去除rhBMP-7蛋白溶液中的内毒素,采用可信度高的的凝胶法测定内毒素含量。寻求实验周期短、结果稳定的体外活性测定方法,是制备可溶性rhBMP-7制剂的重要实验部分。Balb/c3T3细胞作为rhBMP-7的效应细胞,具有对rhBMP-7灵敏度高、实验结果稳定的优点,为rhBMP-7制剂的制备提供了实验依据。
研究目的:
表达rhBMP-7的工程菌存在表达不稳定问题,严重影响后续工作,本论文试图通过对退化菌种的复壮,以获得表达量高、稳定性好的工程菌。包涵体复性工艺优化方面,存在复性率低的问题,本实验在实验室老师所用复性方法的基础上,优化加入添加剂的透析复性工艺,以期得到更多的rhBMP-7活性二聚体。探索疏水色谱法对rhBMP-7纯化并同时复性。尝试制作可溶性rhBMP-7蛋白溶液,并探索应用阴离子交换色谱法去除内毒素,以得到rhBMP-7注射制剂,发挥其对肾脏疾病的治疗作用。NIH3T3细胞作为rhBMP-7体外活性测定细胞,具有实验结果稳定性差的缺点,影响可溶性rhBMF-7注射制剂制备的后续工作。本实验选择Bal/c3T3细胞作为rhBMP-7体外测活的效应细胞,旨在建立实验周期短、结果稳定的体外测活方法。
研究方法:
1.对表达rhBMP-7的退化菌种复壮:①检测退化菌种的质粒丢失情况;②检测质粒的结构是否正确;③根据检测结果,更换载体pBV221,重新构建表达rhBMP-7的工程菌;④对重新构建的菌种进行质粒稳定性检测。
2.采用梯度透析法对rhBMP-7复性,并尝试用疏水色谱法对包涵体蛋白纯化并复性。
3.复性所得蛋白溶液经阴离子色谱柱去除内毒素,凝胶法检测内毒素去除效果。
4.选择Balb/c3T3细胞作为rhBMP-7体外测活的效应细胞,rhBMP-7对细胞作用时采用含0.4%血清的培养基维持细胞存活,rhBMP-7作用浓度在1ng/ml~60μg/ml范围内。
研究结果:
1.经检测,质粒存在于退化菌种。经测定目的基因序列正确,更换载体,重新构建菌种,得到的工程菌目的蛋白表达量达到退化前并且遗传稳定性良好。
2.确定了rhBMP-7透析复性的条件,在4℃、pH8.0条件下,并添加0.4mol/LL-精氨酸的复性液中对rhBMP-7复性效果较好。
3.阴离子色谱柱去除rhBMP-7蛋白溶液中的内毒素,凝胶法测得洗脱液中内毒素含量在注射制剂限值以下。
4.Balb/c3T3细胞作为rhBMP-7体外活性测定的效应细胞,较NIH3T3细胞重复性好、结果稳定。
结论:
本实验室构建的hBMP-7/pBV221/E.coliBL21工程菌发生退化,BMP-7表达量降低,通过对工程菌复壮,得到的工程菌目的蛋白表达量高、遗传稳定性好。在rhBMP-7透析复性液中加入助溶剂L-精氨酸,得到了可溶的活性rhBMP-7蛋白溶液。rhBMP-7体外活性测定方法具有周期短、灵敏度好特点,Balb/c3T3细胞作为rhBMP-7的活性检测效应细胞较NIH3T3细胞具有重复性好、结果稳定的优点。