骨形态发生蛋白-7(bonemorphogeneticprotein-7，BMP-7)是一种有较强活性的生物因子，具有强大的诱导骨组织形成和抗肾纤维化作用，临床上已将rhBMP-7用于骨缺损的修复。 目前获取rhBMP-7的主要途径是利用原核表达系统，但它有些不利方面，如菌种易于产生退化、产生无活性的包涵体。对于退化菌种，需要对其复壮；包涵体蛋白质的复性也是基因工程制药的关键步骤，获得高复性率工艺一直是各个实验室追求的目标。对rhBMP-7的肾脏治疗作用，必须以可溶性注射制剂的形式给药，其内毒素含量需控制在药典规定的注射制剂限值以下。去除内毒素的方法很多，其中廉价、方便、蛋白损失较少的方法是离子交换色谱法。本实验采用阴离子色谱法去除rhBMP-7蛋白溶液中的内毒素，采用可信度高的的凝胶法测定内毒素含量。寻求实验周期短、结果稳定的体外活性测定方法，是制备可溶性rhBMP-7制剂的重要实验部分。Balb/c3T3细胞作为rhBMP-7的效应细胞，具有对rhBMP-7灵敏度高、实验结果稳定的优点，为rhBMP-7制剂的制备提供了实验依据。 研究目的： 表达rhBMP-7的工程菌存在表达不稳定问题，严重影响后续工作，本论文试图通过对退化菌种的复壮，以获得表达量高、稳定性好的工程菌。包涵体复性工艺优化方面，存在复性率低的问题，本实验在实验室老师所用复性方法的基础上，优化加入添加剂的透析复性工艺，以期得到更多的rhBMP-7活性二聚体。探索疏水色谱法对rhBMP-7纯化并同时复性。尝试制作可溶性rhBMP-7蛋白溶液，并探索应用阴离子交换色谱法去除内毒素，以得到rhBMP-7注射制剂，发挥其对肾脏疾病的治疗作用。NIH3T3细胞作为rhBMP-7体外活性测定细胞，具有实验结果稳定性差的缺点，影响可溶性rhBMF-7注射制剂制备的后续工作。本实验选择Bal/c3T3细胞作为rhBMP-7体外测活的效应细胞，旨在建立实验周期短、结果稳定的体外测活方法。 研究方法： 1.对表达rhBMP-7的退化菌种复壮：①检测退化菌种的质粒丢失情况；②检测质粒的结构是否正确；③根据检测结果，更换载体pBV221，重新构建表达rhBMP-7的工程菌；④对重新构建的菌种进行质粒稳定性检测。 2.采用梯度透析法对rhBMP-7复性，并尝试用疏水色谱法对包涵体蛋白纯化并复性。 3.复性所得蛋白溶液经阴离子色谱柱去除内毒素，凝胶法检测内毒素去除效果。 4.选择Balb/c3T3细胞作为rhBMP-7体外测活的效应细胞，rhBMP-7对细胞作用时采用含0.4％血清的培养基维持细胞存活，rhBMP-7作用浓度在1ng/ml～60μg/ml范围内。 研究结果： 1.经检测，质粒存在于退化菌种。经测定目的基因序列正确，更换载体，重新构建菌种，得到的工程菌目的蛋白表达量达到退化前并且遗传稳定性良好。 2.确定了rhBMP-7透析复性的条件，在4℃、pH8.0条件下，并添加0.4mol/LL-精氨酸的复性液中对rhBMP-7复性效果较好。 3.阴离子色谱柱去除rhBMP-7蛋白溶液中的内毒素，凝胶法测得洗脱液中内毒素含量在注射制剂限值以下。 4.Balb/c3T3细胞作为rhBMP-7体外活性测定的效应细胞，较NIH3T3细胞重复性好、结果稳定。 结论： 本实验室构建的hBMP-7/pBV221/E.coliBL21工程菌发生退化，BMP-7表达量降低，通过对工程菌复壮，得到的工程菌目的蛋白表达量高、遗传稳定性好。在rhBMP-7透析复性液中加入助溶剂L-精氨酸，得到了可溶的活性rhBMP-7蛋白溶液。rhBMP-7体外活性测定方法具有周期短、灵敏度好特点，Balb/c3T3细胞作为rhBMP-7的活性检测效应细胞较NIH3T3细胞具有重复性好、结果稳定的优点。