牵牛子为旋花科植物裂叶牵牛Pharbitis nil（L.）Choisy或圆叶牵牛Pharbitis purpurea（L.）Voigt.的干燥成熟种子。始载于《名医别录》,又名黑丑、白丑、二丑等。其味苦性寒,有毒。归肺、肾、大肠经。具有泻水通便,消痰涤饮,杀虫攻积的功效。用于水肿胀满,二便不通,痰饮积聚,气逆喘咳,虫积腹痛等[1]。牵牛子不仅药用历史悠久,炮制历史亦十分悠久。其炮制始见于《雷公炮炙论》,记载为酒蒸法。古代常用炮制方法有酒制法、盐制法、炒制等。《中国药典》（2015年版）收载牵牛子的炮制品规格为炒牵牛子,各省地方炮制规范中亦多采用清炒法。牵牛子生用偏于逐水消肿,杀虫。炒制后毒性降低,药性缓和,免伤正气,易于粉碎和煎出,以消食导滞见长[2]。因此牵牛子生品及炒品具有不同的临床作用特点。本课题属于国家支撑计划“保健食品中违禁物质检测技术研究”课题的一部分,并在此基础上的延伸。目前,有关牵牛子的研究较少,集中于牵牛子药材的化学成分和药理方面。牵牛子的临床应用以炒品为主,目前缺乏对炒牵牛子饮片的相关研究,其炒制的原理,炮制前后成分的变化,炒制工艺等相关研究均很少。《中国药典》（2015年版）中“牵牛子”项下标准与《中国药典》（2010年版）规定一致,没有发生变化,因此,本课题对牵牛子生品及炒品的研究十分具有必要。目的:1.研究牵牛子药材的化学成分,并建立质量评价方法;2.研究牵牛子炒制原理和炒制工艺;3.研究炒牵牛子饮片的化学成分,并建立质量评价方法。方法:1.牵牛子生品和炒品化学成分的比较研究。收集产地为河北的牵牛子药材,并炮制成符合药典性状描述的炒牵牛子饮片。通过HPLC-MS分析牵牛子生品和炒品的化学成分,采用 Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6mm×250mm,5μm）,检测波长为296nm,柱温25℃,流速1.0mL/min,进样体积为10μL,流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸（B）梯度洗脱,质谱使用ESI离子源,在负离子模式下扫描,记录总离子流图,并进行分析。2.使用多指标综合加权评分法优选牵牛子最佳炒制工艺。采用单因素考察法对牵牛子炒制时间进行考察。分别炮制时间为6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min的炒牵牛子样品,以外观性状、醇浸出物含量及水浸出物含量三个指标作为评价指标,通过赋予各指标相应权重系数,计算各炮制水平样品的综合评分,优选牵牛子最佳炒制工艺。3.牵牛子生品和炒品的特征图谱的比较研究。收集10批不同产地牵牛子药材,并按照最佳炮制工艺炮制成相应的炒牵牛子饮片。采用HPLC建立牵牛子、炒牵牛子特征图谱,色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×250mm,5μm）,检测波长:296nm,柱温:25℃,流速1.0mL/min,进样体积:10μL,以0.1%甲酸为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱。4.牵牛子生品和炒品浸出物含量的比较研究。将10批牵牛子药材和10批炒牵牛子饮片分别按《中国药典》（2010年版）附录X A浸出物测定法中醇溶性浸出物测定法项下的冷浸法测定药材和饮片的醇浸出物含量;水溶性浸出物测定法项下的热浸法测定药材和饮片的水浸出物含量。结果:1.通过牵牛子生品及炒品的HPLC及HPLC-MS,共鉴别出16个化合物（牵牛子中13个化合物,炒牵牛子中16个化合物）,分别为酚酸、酚酸内酯、黄酮类,具体化合物为新绿原酸（5-CQA）、绿原酸（3-CQA）、隐绿原酸（4-CQA）、咖啡酸（CA）、5-肉桂酰奎宁酸（5-pCoQA）、5-阿魏酰奎宁酸（5-FQA）、阿魏酸（FA）、绿原酸内酯（3-CQAL）、隐绿原酸内酯（4-CQAL）、3,4-二咖啡酰奎宁酸内酯（3,4-DiCQAL）、异绿原酸B（3,4-DiCQA）、异绿原酸A（3,5-DiCQA）、异绿原酸C（4,5-DiCQA）、槲皮素、槲皮素糖苷、黄酮醇（具体结构未知）等,其中3-CQAL、4-CQAL、3,4-DiCQAL为炒牵牛子特有成分。2.通过对不同水平炒牵牛子样品的外观性状、醇浸出物、水浸出物的测定,采用多指标综合加权评分法计算综合得分,结果显示当炒制时间为10-12min时,综合得分最高,因此优选出的牵牛子最佳炒制工艺为:取净牵牛子200g,在200℃下炒10-12min,取出,放凉,即得。3.分析不同产地牵牛子药材HPLC特征图谱,发现生品特征图谱共有17个共有峰,指认了其中的7个峰;炒牵牛子饮片特征图谱共有21个共有峰,指认了其中的7个峰。对比牵牛子炒制前后的HPLC特征图谱可知,炒牵牛子比牵牛子特征图谱共有峰增加了4 个,另外 CA、3-CQA、3,5-DiCQA 等峰含量降低,5-CQA、4-CQA、3,4-DiCQA、4,5-DiCQA等峰含量升高。通过对特征图谱的稳定性、重复性、精密度等方法学考察可知,各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均符合要求,表明建立的牵牛子特征图谱、炒牵牛子特征图谱均符合中药指纹图谱建立的技术要求,可用于定性分析。4.分别测定了河北、四川、辽宁等10个不同产地的牵牛子生品、炒品中浸出物的含量。结果发现,10批牵牛子药材中醇浸出物（冷浸法）含量变化范围为17.24%～20.51%,水溶性浸出物（热浸法）含量变化范围为33.57%～37.04%;10批炒牵牛子饮片中醇溶性浸出物（冷浸法）含量变化范围为16.36%～17.33%,水溶性浸出物（热浸法）含量变化范围为39.12%～42.03%。对比发现,牵牛子、炒牵牛子批间差异均不明显,表明产地对牵牛子浸出物含量的影响不大;比较牵牛子和炒牵牛子浸出物实验结果可知,牵牛子炒制后醇浸出物含量降低,均值从19.05%降到16.77%,水浸出物含量升高,均值从35.42%升到40.22%。由于水浸出物也是药材及饮片有效成分的一部分,因此建议药典增加对牵牛子及炒牵牛子水浸出物含量的控制。经水浸出物含量范围的计算,建议牵牛子药材水溶性浸出物含量以干燥品计不低于29.75%为宜,炒牵牛子饮片水溶性浸出物含量以干燥品计不低于34.25%为宜。结论:1.本研究为首次从牵牛子中检出槲皮素、槲皮素糖苷等黄酮类物质,同时也是首次从牵牛子中检出黄酮类成分;通过对牵牛子生品、炒品化学成分的对比分析,发现牵牛子炒制后化学成分种类和成分含量均发生了变化,种类方面,3-CQAL、4-CQAL、3,4-DiCQAL三个成分为炒牵牛子质谱中解析得到,且在牵牛子生品中未发现,故三者为炒牵牛子特有成分;成分含量变化方面,CA、3-CQA、3,5-DiCQA含量较生品降低,5-CQA、4-CQA、3,4-DiCQA、4,5-DiCQA含量较生品升高。该方法可较为全面了解牵牛子炒制前后主要化学成分的变化规律,为牵牛子炮制机理及其饮片质量标准研究提供化学物质基础信息。2.验证试验表明优选出的工艺各项指标稳定,因此,优选出的炒牵牛子最佳炮制工艺具有合理性。3.分析不同产地牵牛子药材HPLC特征图谱,发现牵牛子色谱图整体相貌基本相同,特征峰的相对保留时间和相对峰面积差异不大,说明各产地牵牛子药材所含化学成分的组成基本一致,各批药材间质量具有稳定性;各批炒牵牛子饮片特征峰的相对保留时间和相对峰面积亦差异不大。对比牵牛子炒制前后的HPLC特征图谱并计算主要化学成分的相对峰面积,发现炒制后特征图谱发生明显变化。因此,HPLC特征图谱可以快速有效鉴别牵牛子药材、炒牵牛子饮片,并可用于二者的整体质量评价,从而为有效的控制药材内在质量标准提供了科学依据。4.对比浸出物含量发现,不同产地对牵牛子药材浸出物含量的影响不大;比较牵牛子和炒牵牛子浸出物结果可知,牵牛子炒制后醇浸出物含量降低,水浸出物含量升高。有研究指出,牵牛子炒后挥发油类含量降低,产生香气,因此炒后醇浸出物含量降低可能与这些物质的降低有关;另外,牵牛子炒后质地酥脆易碎,易于煎出有效成分,因此水浸出物含量升高,这与传统的“逢子必炒”观点吻合。