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白血病是严重危害人类生命健康的恶性疾病，也是我国十大高发恶性肿瘤之一。迄今白血病的治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗，但此疗法副作用大，复发率高，且对机体正常免疫与造血系统有极大的损害。中药以其调节阴阳平衡、注重整体、攻补兼施、毒副作用小、应用范围广等优势得到了医学界的广泛认可和重视，中药及其有效成分的抗肿瘤机理研究已成为当今医学研究的热点，也将为人类肿瘤的治疗开辟新的途径。
柴胡皂甙d(Saikosaponins-d，SSd)是从传统中药柴胡中分离、提取出来的一种具有糖皮质激素样甾类环结构的皂甙衍生物。研究表明，柴胡皂甙d具有抗炎、抗惊厥、诱导细胞分化、调节免疫、抑制细胞增殖以及诱导细胞凋亡等多效生物效应。目前，国内外学者把柴胡皂苷d应用于肾病、肝纤维化、肿瘤等疾病的治疗，并取得可喜成就，尤以柴胡皂甙d抗肿瘤作用的研究倍受瞩目。随着研究的深入，发现柴胡皂甙d的抗肿瘤作用机理主要涉及调节机体免疫、抑制肿瘤细胞分裂与生长、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移、调节肿瘤细胞信号传导以及细胞毒作用等，其抗肿瘤作用是通过多靶点、多途径、多环节来实现的。
为进一步阐明柴胡皂甙d的抗肿瘤作用机制，探讨其对白血病细胞生长及转录水平的影响，我们采用寡核苷酸芯片技术从全基因组水平上研究了K562细胞基因的表达谱变化，从而在基因水平上对柴胡皂甙d抗肿瘤的具体作用机制进行研究，为后续的药物临床研究与开发提供实验依据。
本研究分为以下两部分：
第一部分：柴胡皂甙d对K562细胞增殖和凋亡的实验研究。
将细胞随机分为5组，对照组为含0.1％DMSO的培养基，其余4组分别为含不同浓度SSd的培养基，五组细胞分别培养0h、12h、24h、48h和72h后，CCK-8比色法测定其对细胞生长的影响，流式细胞术(AnnexinV-FITC-PI)、细胞形态学(Hoechst33258染色)以及梯状DNA电泳等方法检测细胞凋亡。研究结果发现：
1、SSd处理前后不同时间之间OD值有显著差异(F=121.567，P<0.001)。除8μg/ml浓度组不同时间点之间的OD值无显著差异(F=1.796，P=0.169)外，其余各浓度组OD值均有显著差异(P<0.001)，雅分别为35.454、46.282、42.201和18.014，且OD值随时间呈显著上升趋势。随药物作用时间的延长，8μg/ml浓度组的OD值有先升高后下降的变化趋势，以0h时较低，24h时最高，72h最低。
2、对照组OD值显著高于其它各药物浓度组(F=65.547，P<0.001)。从各时间点看，不同浓度组之间OD值的比较均有显著差异(P<0.032)，以8μg/ml浓度组OD值最低，对照组最高。
3、不同药物浓度与不同时间点之间存在交互效应(F=12.275，P<0.001)，表明随着时间的变化，各组的OD值变化幅度不同，最大值在对照组72h，最小值在8μg/ml浓度组72h。
4、时间因素不同水平间的多重比较均有显著性差异，均P<0.050。除1μg/ml和2μg/ml浓度水平间无显著差异外(P=0.854)，其余浓度因素不同水平间的两两比较都有显著性差异(P<0.050)。
5、8μg/mlSSd作用K562细胞48h后，部分细胞染色质浓缩聚集，细胞核在光镜下呈浓染致密的颗粒块状荧光，呈现明显的细胞凋亡形态。DNA凝胶电泳出现典型的凋亡“梯状”条带。随着SSd浓度的增高(1-8μg/ml)，流式细胞仪检测细胞的凋亡率也逐渐上升，分别为13.01％、18.29％、35.58％和43.41％，而对照组凋亡率为0.33％。
以上结果表明SSd能有效抑制K562细胞的生长并诱导其凋亡，抑制效应呈明显的时间.剂量依赖关系。
第二部分：应用AgilentHuman1A寡核苷酸芯片系统研究SSd诱导K562细胞凋亡的基因表达谱变化。
8μg/mlSSd作用48h后，分别提取对照组和处理组K562细胞的总RNA，利用AgilentRNA荧光线性扩增试剂盒合成荧光标记的cRNA，SSd处理组用Cy5标记，对照组用Cy3进行标记。标记好的cRNA样品经纯化后与寡核苷酸芯片杂交，Agilent2565BA基因芯片扫描仪进行扫描，AgilentFeatureExtraction软件进行数据分析及标准化处理。根据软件给出的LogRatioPValue确定表达差异的基因，结合PANTt-IER数据分析系统将这些基因按照生物学功能进行归类，并通过查阅GenBanK数据库及相关文献对部分差异显著基因进行深入的分析和讨论。
实验结果表明在检测的18716个基因和EST中，共筛出差异表达基因359个，其中138个基因表达上调，221个基因表达下调。这些差异表达基因主要包括以下几类：①与mRNA转录调控相关；②与细胞黏附有关；③与G蛋白介导的信号传导相关；④与氧化磷酸化相关；⑤与细胞增殖和分化相关：⑥与细胞凋亡相关；⑦与免疫防御机制相关；⑧与细胞周期相关等。通过对细胞增殖分化相关基因PEG10、EMP2；凋亡相关基因CASP3、CASP8；mRNA转录调控相关基因CLOCK以及原癌基因TACC3等差异表达基因的功能及其在代谢通路中的具体作用进行了详细的分析后，我们认为SSd诱导细胞凋亡效应主要是通过调节细胞增殖与分化基因和凋亡相关基因的表达，从而抑制K562细胞增殖、促进细胞凋亡。而昼夜节律基因的高表达及癌基因的表达下调说明SSd能提高机体抵御肿瘤、防止肿瘤进一步恶化发展的能力，同时还可能提高肿瘤细胞对SSd作用的敏感性。
本研究首先采用CCK-8细胞活力检测、Hoechst33258细胞核染色、流式细胞术(AnnexinV-PI)以及DNA片段化分析等方法观察了柴胡皂甙d对人白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，SSd能有效抑制K562细胞增殖并诱导细胞凋亡。其次，在明确SSd诱导K562细胞凋亡的基础上，结合基因芯片技术，进一步研究SSd作用K562细胞后的基因表达谱变化，通过对差异表达基因的生物学功能予以分类，结合其在代谢通路中的具体作用，从分子水平上对SSd的抗肿瘤机制进行了初步探讨，为SSd进一步应用到肿瘤临床治疗提供了实验依据和研究思路。