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急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是指一种由多种侵袭因素(如缺血、药物、毒素等)造成肾功能在短期内急性减退的临床综合征,迄今仍无有效治疗手段。肾小管上皮细胞是缺血、药物、毒素等侵袭因素导致AKI的主要靶细胞,AKI可引起肾小管上皮细胞变性、凋亡、坏死以及脱落,造成肾小球滤过率下降。因此,从逆转肾小管上皮细胞的损伤过程入手,寻找一种有效的治疗AKI的手段具有十分重要的研究价值与临床意义。近来研究发现,黏附因子CD44在正常肾脏组织内无表达或表达极少,但在部分增殖性肾脏疾病及炎症性肾脏疾病中CD44蛋白表达可异常增高,而透明质酸(hyaluronic acid,HA)正是黏附因子CD44的天然存在的特异性配体之一,且HA具有良好的水溶性、分子中众多的羟基和羧基,这为肾小管上皮细胞靶向前体药物的研发提供了可能。本课题以HA作为载体,具有抗氧化应激作用的姜黄素(Curcumin,CUR)为模型药物,来构建透明质酸接枝姜黄素前体药物(HA-CUR)用于急性肾损伤的靶向治疗。通过促进药物在病变肾脏部位的有效蓄积,在提高药物疗效的同时,降低药物潜在的副作用。在脱水剂二环已基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)和催化剂4-二甲氨基吡啶(4-Dimethylaminopyridine,DMAP)作用下,利用HA(分子量:4000)上羧基与CUR羟基之间的酯化反应,合成HA-CUR前体药物。采用核磁共振对所得的前体药物进行结构确证,结果表明已经成功合成了目标结合物。合成的HA-CUR前体药物为深黄色固体粉末,其中CUR含量为8.57 ±0.69%。HA-CUR的平衡溶解度实验结果显示,CUR的平衡溶解度为226.8 ±7.3 μg/mL,相比于游离的CUR(8.4 ± 1.3 μg/mL)提高了 27倍。采用透析袋法分别考察HA-CUR和游离CUR在PBS(pH 7.4)和含10%胎牛血清的PBS(pH 7.4)中的体外释放行为,结果HA-CUR可显著延缓CUR的释放,12小时内累积释放出约80%的药物,且在PBS(pH 7.4)和含10%胎牛血清的PBS(pH 7.4)中的释放行为无显著差异。利用荧光显微镜观察HA-CUR的细胞摄取。结果表明,相比于正常的肾小管上皮(HK-2)细胞,HA-CUR更容易被氧化应激(H2O2)损伤的HK-2细胞所摄取。另外,氧化应激损伤的HK-2细胞对HA-CUR的摄取也要多于游离CUR。采用近红外荧光探针吲哚菁绿(ICG)标记HA-CUR,以AKI裸鼠为模型进行活体近红外成像实验,结果显示荧光信号在AKI裸鼠中的分布主要在肾脏组织,且维持时间超过24小时。相比之下,对照组裸鼠肾脏部位无明显的荧光信号分布。以游离CUR组为对照组,采用超高效液相色谱法测定药物浓度,考察HA-CUR的体内分布情况,结果显示游离CUR组药物主要分布在肺部,且较快代谢消除;而HA-CUR组药物在肾脏的分布显著增加,且明显高于其他非靶部位。本课题采用肾缺血再灌注来构建AKI小鼠模型,免疫组化法考察AKI小鼠肾脏中CD44的表达情况,结果表明,相比于对照组,AKI小鼠肾小管CD44的表达明显增加。此外,我们采用免疫印迹法对CD44的表达进行测定并得出一致的结论,即AKI发生时,肾脏CD44表达显著升高,这为HA-CUR用于肾靶向治疗提供足够的依据。最后对HA-CUR的体内药效学进行评价,以肾缺血再灌注(Ischemia-reperfusioninjury,IRI)来构建AKI小鼠模型,通过尾静脉注射给药,考察并评价游离CUR和HA-CUR对模型小鼠的体内药效。结果显示:给药24 h后,HA-CUR降低血清肌酸肝(serum creatinine,Scr)和血液尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平的作用要强于游离CUR;苏木精-伊红(HE)染色给药24 h后小鼠肾脏组织,观察其病理形态变化,发现经HA-CUR治疗后,AKI小鼠肾脏出现的小管坏死和堵塞的情况得到明显的改善,且效果要优于游离CUR;AKI小鼠肾脏内致炎因子水平降低,氧化应激水平被抑制,且HA-CUR组强于游离CUR组;采用免疫印迹法对肾脏组织中凋亡相关蛋白进行测定,结果显示,HA-CUR可显著降低凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达,升高Bcl-2的水平,且作用要优于游离CUR。研究结果表明,所构建的HA-CUR前体药物在AKI小鼠模型体内,可通过与氧化应激损伤的肾小管上皮细胞结合,改善其体内分布,提高药物在靶部位的治疗效果。结果提示,将透明质酸接枝姜黄素后,有望通过药物的肾靶向蓄积,减少非靶位组织的分布,减少给药频率,降低药物毒性,实现对AKI的安全、有效治疗。