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研究背景慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis,CRS)是鼻腔及鼻窦黏膜的慢性非特异性炎性疾病。CRS的发病机制尚不明了,目前研究报道可能与细菌、病毒等病原体的感染,炎症因子的刺激有关,尤其是金黄色葡萄球菌,且金葡菌对鼻黏膜上皮细胞有侵袭作用,造成细胞凋亡。研究发现,在饥饿、细菌感染等应激条件下,机体会启动自噬,维持细胞稳态。细胞自噬是溶酶体降解受损细胞器及某些大分子物质的过程,此过程受自噬相关基因调控。在机体的生理和病理情况下都可以见到自噬,但其在某一特定疾病中究竟是起着怎样的作用,正面的还是负面的,尚未完全阐明,对CRS的研究更是如此,因此值得深入探究。目的本课题通过金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)感染人鼻黏膜上皮细胞诱导出炎症细胞模型模拟CRS的炎症反应,探索CRS中自噬与凋亡可能的关系,为以后研究开发CRS新的治疗靶点提供一个新的思路。方法(1)绘制金葡菌标准生长曲线,确定其在本实验条件下的对数生长期,且此期的细胞将用于后续实验中。(2)细胞毒性实验:将接种后的细胞培养板放入细胞培养箱中培养,分别在最后加3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)之前4h、10h、16h、22h时以感染复数(Manual Optical Inspector,MOI)分别为1、10、25、50、100加入提前配好的相应细菌继续共培养,酶标仪检测各组在570nm处的OD值,以确定金葡菌感染细胞的最佳感染复数;另取接种好的细胞,以雷帕霉素浓度分别为100nmol/L、200nmol/L、1000nmol/L,巴弗洛霉素浓度分别为1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L预处理细胞2小时后换液,继续培养,行MTT实验,验证实验用的200nmol/L的雷帕霉素或10nmol/L的巴弗洛霉素对于人鼻粘膜上皮细胞而言是否安全。(3)摸索腺病毒感染细胞最佳MOI实验:本实验中分别以MOI为30、100、300、1000的mRFP-GFP-LC3腺病毒感染人鼻黏膜上皮细胞,荧光显微镜下拍照分析,需从感染效率、荧光强度及细胞形态完整性综合分析来选择最佳MOI值。(4)Western blot(蛋白免疫印迹)实验:构建人鼻黏膜上皮细胞金葡菌感染模型,自噬以及凋亡基因调控相关蛋白在人鼻黏膜上皮细胞上的表达水平通过Western blot检测,自噬基因调控相关蛋白包括:Beclin 1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、P62,凋亡基因调控相关蛋白为cleaved-caspase3,内参蛋白为β-actin;各蛋白抗体稀释比例为:β-actin(1:500),Beclin l(1:1000)、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ(1:1000)、P62(1:1000)、cleaved-caspase3(1:800),4℃冰箱摇床孵育过夜;对应二抗稀释比例为1:2000,室温摇床孵育2小时;ECL显影拍照,ImageJ软件分析数据.后期200nmol/L的雷帕霉素或10nmol/L的巴弗洛霉素对细胞预处理后,重复上述实验步骤,检测蛋白表达。(5)Flow cytometry(流式细胞术)实验:构建人鼻黏膜上皮细胞金葡菌感染模型,取5-10万PBS重悬的细胞,离心,弃去上清,首先加入195微升Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入5微升Annexin V-FITC,轻轻混匀,加入10微升碘化丙啶(PI)染色液,轻轻混匀。室温避光孵育15分钟后置于冰浴中,流式细胞仪检测人鼻黏膜上皮细胞凋亡情况,200nmol/L的雷帕霉素或10nmol/L的巴弗洛霉素对细胞预处理后,重复上述实验操作步骤,检测雷帕霉素或巴弗洛霉素预处理改变自噬后金葡菌感染细胞凋亡的情况。(6)CLSM(激光扫描共聚焦显微镜)实验:将状态良好的细胞接种到铺有无菌玻片的24孔细胞培养板,待细胞汇合率介于50%至70%时感染mRFP-GFP-LC3腺病毒(购自中国上海汉恒生物),金葡菌感染瞬时表达mRFP-GFP-LC3腺病毒的人鼻黏膜上皮细胞,mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒中表达的绿色荧光和红色荧光用于标记及追踪LC3,绿色荧光减弱代表自噬溶酶体形成,它是由溶酶体与自噬小体的融合形成的,由于绿色荧光蛋白对于PH小于5的酸性环境比较敏感,所以当自噬溶酶体形成后,绿色荧光会发生淬灭,而红色荧光仍然可以被检测到;激光扫描共聚焦显微镜拍照后将红绿色荧光行merge处理,此时通过merge而出现的黄色荧光斑点代表自噬体,红色荧光斑点代表自噬溶酶体,自噬流的变化便可以通过不同荧光斑点计数而清楚的看出,运用医学绘图软件Graphpad prism 7统计并分析细胞自噬变化。结果(1)本实验研究条件下,金葡菌的对数生长期大约在2-4.5小时,因此可选用此期间的金葡菌应用于后续实验;(2)MTT实验中,金葡菌感染细胞适宜MOI为25,且200nmol/L的雷帕霉素或10nmol/L的巴弗洛霉素对于人鼻黏膜上皮细胞是安全的,可用于实验;(3)MOI为30时,感染效率最低,而MOI为300和1000时,感染效率很高,但部分细胞形态改变,出现凋亡。只有MOI为100时,感染效率高于MOI为30,且细胞形态正常。因此本实验中以MOI=100的mRFP-GFP-LC3腺病毒感染细胞待其稳定表达后行后续实验。(4)Western blot、Flow cytometry、CLSM实验结果:金葡菌感染的人鼻黏膜上皮细胞凋亡相关蛋白表达及细胞凋亡增高,同时伴随着细胞自噬调控蛋白Beclin 1,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达增高,P62表达降低;加用自噬抑制剂BafA1后,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、P62表达相较于对照组增加,cleaved-caspase3的表达及细胞凋亡相较于对照组均进一步增高。而加用自噬诱导剂RaPa后,Beclin 1和LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ表达相较于对照组增加,而cleaved-caspase3表达及细胞凋亡相较于对照组则显著降低。结论金黄色葡萄球菌的感染可以诱导人鼻黏膜上皮细胞发生凋亡并激活自噬;增强的自噬对细胞起着一定的保护作用,可以减少金葡菌感染诱导的人鼻黏膜上皮细胞的凋亡,这可能为CRS的诊断和治疗提供新的研究方向。