磷脂酶D催化磷脂酰基转移合成磷脂酰丝氨酸反应的研究

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磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称PS)作为生物膜中一种重要的磷脂类物质,能够调控细胞膜上的蛋白质,是细胞膜上的活性物质。磷脂酰丝氨酸的主要功能有:改善神经细胞功能,调节神经脉冲的传导,增进大脑记忆功能等生理作用,在保健品以及医药行业的用途非常广泛。但是,自然界中天然的磷脂酰丝氨酸含量非常稀少,不足以满足人们对PS的需求,因而磷脂酰丝氨酸的合成是十分必要的。常用的磷脂酰丝氨酸的合成方法是酶转化法,其具有成本低,条件温和等优点。本文研究磷脂酶D催化大豆磷脂酰胆碱(PC)的转磷脂酰基反应合成磷脂酰丝氨酸的反应规律,为工业应用提供理论参考。采用两相体系中磷脂酶D催化的转磷脂酰基反应合成磷脂酰丝氨酸,大豆磷脂溶于有机相,L-丝氨酸溶于水相。主要研究了有机溶剂、底物摩尔比、pH、两相体积比、反应温度等因素对反应的影响。通过对磷脂酰基转移反应合成PS反应条件的研究,得出PS制备的最佳反应条件为:有机溶剂为乙醚,温度为28℃,底物摩尔比(L-丝氨酸:PC)为100,pH=5.5,两相体积比(V有机:V水相)为2。在此条件下合成磷脂酰丝氨酸,反应液中PS的浓度高达7.57mmol/L,对PS收率达58.4%。研究了磷脂酰基转移反应副产物胆碱对磷脂酶D催化反应的影响,提出了酶促反应的动力学模型,建立了产物抑制动力学的方程。通过模拟不同胆碱浓度下的催化反应速率、L-B法处理动力学数据,证实产物胆碱对磷脂酶D催化反应的抑制类型为竞争性抑制,并求出动力学参数,28℃、pH=5.5下米氏常数和抑制常数分别为15.7mmol/L和9.16mmol/L。游离酶对于外界环境非常敏感,容易失活,并且难于从反应中分离,采用固定化的方法使酶与载体结合,不仅可以达到分离的效果,而且可以重复使用。考察了固定化酶的耐热性、操作稳定性、保存稳定性,通过研究得到固定化酶的耐热性增加;重复利用5次以后,剩余的相对酶活力依然大于40%,而游离酶反应一次后已经失活;4℃的条件下保存50 d后,固定化酶仍然保存32%的活力,而游离酶在40 d已完全失活。为了缓解胆碱对酶的抑制作用,采用反复分批式操作方法降低反应体系中的胆碱浓度。固定化酶催化的分批式反应中,移除胆碱,催化反应速率明显增加。提高催化反应速率和产物收率,PS的最大收率达58.9%。
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