研究背景和目的：在我国,因各种原因导致的骨髓造血功能障碍性疾病比较常见。近年随着环境污染的加剧,各类电子设备的普及以及室内装修的复杂化,这类疾病的患者的数量有明显的上升,成为严重威胁生命的疾病。骨髓衰竭综合征(Bone marrow failure syndromes, BMFS)是一组源于造血干细胞水平损伤的骨髓衰竭疾病,累及血细胞一系或多系。骨髓衰竭性疾病包括先天遗传性和获得性两大类。遗传性骨髓衰竭综合征因骨髓造血干细胞增殖、分化障碍及造血微环境异常所致,是以骨髓衰竭、癌症倾向及先天畸形为表现的一组疾病,可表现为全血细胞减少,如范可尼贫血(FA),先天性角化不良(DC), Shwachman-Diamond综合征(SDS),也可表现为单系细胞减少,如先天性巨核细胞性发育不良血小板减少(CAMT), Diamond-Blackfan贫血(DBA)；获得性骨髓衰竭疾病由后天细胞免疫紊乱造血微环境异常、造血细胞生长因子分泌异常引起,其中以获得性再生障碍性贫血(Aplastic anemia, AA,简称再障)最常见。再障是血液系统常见的疾病,是由多种病因、多种发病机理引起的骨髓造血功能衰竭的一种综合病症,基本病变为骨髓造血干细胞及造血微环境损伤,免疫功能紊乱,骨髓脂肪化,红髓容量减少,导致造血功能衰竭,外周血全血细胞减少,继发严重感染、出血和贫血而危及患者生命。再障成为困扰医疗界的一大难题,骨髓移植是治疗再障首选措施,但由于受年龄及来源限制,免疫抑制剂和雄激素类药物,存在副作用大复发率高的问题。目前对免疫抑制治疗无效或复发的患者尚缺乏有效治疗方法,临床上亟待探索新的治疗手段。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一种具有多分化潜能的非造血干细胞,为中胚层来源的多能干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有多向分化的潜力,获取方便,易于分离培养和鉴定、旁分泌效应、促进血管生成、免疫调节和免疫耐受功能等优点,因其不涉及伦理道德问题,被认为是最有希望用于治疗多种疾病的干细胞。BMSCs是构成骨髓微环境的重要组成成分,主要功能是参与造血干细胞的生存和分化,维持造血微环境,不仅可表达多种造血细胞因子,具有支持造血功能,还具有免疫调节的特性。AA患者的BMSCs存在质和量的异常,其造血支持和免疫调节存在缺陷。BMSCs因具有支持造血及免疫调节的双重作用,在骨髓衰竭疾病的细胞治疗中可能发挥重要作用。BMSCs本身具有较低的免疫原性,且具有可移植性,异基因BMSCs不但可以进入受体体内,而且可在体内较长期存在。BMSCs归巢是指自体的或外源性的BMSCs在多种因素的作用下穿过内皮细胞定向迁移至靶向组织血管并定植的过程。因其具有多器官归巢、优先定位于受损伤靶器官、参与细胞分化及免疫调节等特点,已被广泛应用于allo-HSCT后GVHD的预防与治疗、器官移植后排斥反应的预防以及组织工程及各种自身免疫性疾病的治疗等方面。目前有关BMSCs在体内存活及归巢的机制尚未明确,已开展的动物实验研究中BMSCs的输注量、途径、移植模型的建立等方面均存在明显差异,从而导致BMSCs在体内分布不同,严重影响BMSCs的临床应用。但目前有关静脉输注BMSCs在骨髓衰竭模型体内归巢与分布的研究较少,其发挥治疗作用的具体机制尚不清楚。因此本实验在成功分离纯化、传代培养和扩增小鼠BMSCs的基础上,以免疫介导的骨髓衰竭模型为基础,观察静脉输注同种异体BMSCs对骨髓衰竭小鼠模型的治疗效果,并应用亲脂性膜荧光染料氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)标记BMSCs,探讨BMSCs是否在同基因正常小鼠与骨髓衰竭模型中的归巢及迁移方面存在的差异。本研究包括三部分内容：小鼠BMSCs的分离、培养及鉴定；BMSCs对骨髓衰竭模型造血和免疫功能的影响；BMSCs在骨髓衰竭小鼠体内的分布与归巢研究。第一部小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和生物学特性目的：分离和培养小鼠BMSCs,研究其生物学特征,为动物实验做准备。方法：取4周龄正常雄性BALB/c小鼠的股骨,无菌状态下冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬液,接种于塑料培养皿,每3-4天按照1：3进行常规方法传代；倒置显微镜下观察细胞形态学特点,流式细胞仪检测BMSCs的表面标志,诱导BMSCs向成骨细胞及成脂细胞培养及鉴定。结果：小鼠BMSCs贴壁生长后形态较均一,细胞形态呈成纤维细胞样,P3代细胞流式细胞术检测：CD29为97.23%,CD44为99.67%,CD90为53.75%,CD105为29.83%；造血系抗原低表达：CD34为4.12%,HLA-DR为5.40%,可向成骨细胞及成脂细胞分化。结论：全骨髓细胞贴壁培养法可成功分离和培养出小鼠BMSCs,分离所得的细胞性状稳定、状态良好,形态学和表型,分化符合BMSCs特点。第二部分间充质干细胞对骨髓衰竭小鼠的造血和免疫功能的影响目的：探讨同种异体BMSCs对骨髓衰竭小鼠造血和免疫功能的影响。方法：将健康10周龄SPF级雌性BALB/c小鼠30只随机分为3组,每组10只,分别为空白对照组(A组)、骨髓衰竭模型组(B组)、MSCs治疗组(C组)。采用免疫介导方法建立(60Co γ-射线照射后输入淋巴细胞)骨髓衰竭小鼠模型。BALB/c小鼠经5Gy γ射线照射后,输入5×106个DBA/2小鼠的淋巴结细胞制成骨髓衰竭模型。于第3天将BMSCs经尾静脉输注给C组小鼠,B组经尾静脉仅输注等量的PBS液。小鼠濒死或造模第14天,观察各组小鼠的平均生存时间、外周血血像和骨髓形态学特征。采用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群,分析CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞的百分率,CD4+/CD8+比值。ELISA方法检测外周血上清细胞因子IFN-γ口IL-2的水平。统计学处理：计量资料以x±s表示,应用SPSS13.0软件完成统计处理,生长曲线采用两独立样本t检验,多组均数的比较采用单因素方差分析法,两两比较采用Bonforroni法,绘制Kaplan-Meier生存函数曲线并对其进行Log Rank检验,P<0.05为差异有显著性意义。结果：小鼠濒死或造模第14天C组的白细胞(P=0.022)、血红蛋白(P=0.001)、血小板(P=0.036)、骨髓单个核细胞数(P=0.036)与B组相比显著升高。B组平均生存时间为(11.50±0.47)天,C组平均生存时间为(13.20±0.28)天,C组比B组平均生存时间显著延长(P=0.035)。B组小鼠外周血涂片和骨髓涂片提示,骨髓活检显示骨髓造血细胞明显减少。C组小鼠外周血涂片和骨髓涂片提示增生相对活跃、可见多个有核细胞。小鼠濒死时或造模第14天时,与A组相比,B组CD3+CD4+百分比、CD3+CD8+百分比、CD4+/CD8+比值显著下降(P<0.001)。与B组相比,C组CD3+CD4+百分比、CD3+CD8+百分比、CD4+/CD8+比值显著升高(P<0.001)。小鼠濒死时或造模第14天时,B组与A组比较,血浆IFN-y和IL-2含量明显升高,具有显著性差异(P均小0.000)；C组与B组比较,IFN-y和IL-2含量明显降低,具有显著性差异(P=0.011；P=0.036)。结论：通过对受鼠进行放射性核素照射和供鼠淋巴结细胞输注,模型小鼠的各项检测指标均达到骨髓衰竭的诊断标准。未经治疗的小鼠大部分死亡,血细胞减少和骨髓衰竭。输注BMSCs的小鼠半数存活,生存时间显著延长,血细胞和骨髓有所恢复,CD4+/CD8+比值显著上升,血浆IFN-γ、IL-2显著降低,一般状况改善。表明BMSCs能促进骨髓衰竭小鼠的造血恢复,减轻骨髓衰竭程度,调节免疫功能,抑制造血负调控因子的活性,对骨髓衰竭有治疗作用。第三部分骨髓间充质干细胞在骨髓衰竭小鼠体内的归巢的研究目的：探讨同种异体BMSCs在骨髓衰竭小鼠和正常小鼠体内归巢是否存在差别。方法：在体外以标记CM-Dil的BMSCs作为实验组,以未标记CM-Dil的BMSCs作为对照组,比较两组细胞生长与增殖情况,MTT法检测细胞生长增殖情况。健康10周龄SPF级BALB/c小鼠20只,随机分为4组,每组5只,分别为对照A组、对照B组、骨髓衰竭模型A组、骨髓衰竭模型B组,采用免疫介导方法建立(60Co γ-射线照射后输入淋巴细胞)骨髓衰竭小鼠模型。以同基因正常小鼠及免疫介导的骨髓衰竭小鼠为基础,将亲脂性膜荧光染料氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)标记的BMSCs于第3天经尾静脉注射各组小鼠体内。分别于不同时间点处死小鼠取骨髓制成单个核细胞悬液,应用流式细胞仪检坝CM-DiI阳性标记细胞的分布比例,荧光显微镜分别观察供体细胞在各受鼠体内的分布。统计学处理：计量资料以x±s表示,应用SPSS13.0软件完成统计处理,采用配对t检验,P<0.05为差异有显著性意义。结果：体外培养结果显示,两组BMSCs在细胞生长、增殖、分裂以及形态学上均基本相似,在绿色光激发下,CM-Dil发出红色荧光,24小时后细胞标记率为95%,14天后CM-Dil标记的BMSCs荧光仍清晰可见。BMSCs移植后24小时和第7天,骨髓衰竭模型组骨髓中CM-DiI阳性标记细胞均多于对照组(t=-18.597,P<0.001; t=-24.444,P<0.001),对照B组CM-DiI阳性细胞显著多于对照A组(t=-33.538,P<0.001),骨髓衰竭模型B组CM-DiI阳性细胞显著多于骨髓衰竭模型A组(t=-50.994,P<0.001)。结论：BMSCs归巢至骨髓衰竭小鼠骨髓的数量比正常小鼠多,24小时即可归巢至骨髓且第7天在骨髓中含量明显增多,表明BMSCs能通过血液循环归巢至受损骨髓组织内,从而发挥造血支持、组织修复和免疫调节作用。