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微流控芯片(又称芯片实验室lab-on-a-chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的芯片上,用以完成不同的生物或化学反应过程,并对其产物进行分析的一种技术。它又被称为微全分析系统(Miniaturized total analysis stystem, μ-TAS)。由于微流控芯片具有分析快速快、耗样量极低、操作简单和易于自动化等特点,因此该分析技术自90年代初兴起以来起就倍受瞩目。微流控芯片前沿应用领域之一是基因结构与功能的研究,包括寡核苷酸、RNA、基因分型及DNA测序。到目前为止,微流控芯片已对短寡核苷酸片段,DNA限制性片段,RNA核糖体等进行了分离分析研究。由微流控芯片所进行的基因分型是一个发展相当迅速的领域,可以对与各种遗传病有关的基因进行快速鉴定,这对临床诊断与法医学鉴定具有重要的意义。血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)中的惟一初始底物,血浆中AGT水平的高低,直接影响着RAS系统活性的强弱,AGT基因被认为是高血压的候选基因之一,但在我国分子流行病学中对AGT的研究尚不多,并且目前采用微流控芯片电泳的技术来探索人群AGT基因多态性分布的研究国内外尚未见报道。目的:1. 以微流控芯片为平台,以激光诱导荧光为检测手段,为大连地区汉族人群AGT基因-6G→A位点基因多态性分析提供一高效、快速和<WP=5>灵敏的检测技术。2.运用微流控芯片技术对临床常见的病原体结核(tuberculosis,TB)和丙型肝炎(hepatitis C virus ,HCV)基因进行快速检测。3.微流控芯片电泳与琼脂糖凝胶电泳及临床已建立的方法进行比较。方法:1. 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism, PCR-RELP)的方法,分别运用微流控芯片电泳与琼脂糖凝胶电泳对大连地区汉族人群103例正常人与123例高血压患者AGT基因(-6)位点的多态性进行分析。2. 利用微流控芯片分析系统,对临床疑诊的15例TB患者待检痰液标本与32例HCV患者的待检血清标本中的病原体结核杆菌和丙型肝炎病毒基因扩增产物进行检测,并与临床上已有的检测方法:杂交梳和实时荧光PCR的方法(real-time PCR)进行比较。结果:1. 微流控芯片能在250s内对样品量为pl-μl的AGT基因PCR产物酶切片段进行芯片电泳分析,酶切片段迁移时间的相对标准偏差(relative standard deviation ,RSD)为0.12%～0.26% <1%(n=6)。而琼脂糖凝胶电泳的分析时间是30min,耗样量为10μl,用酶切产物的稀释比作为衡量检出限的指标,平板电泳上可见产物区带最终稀释倍数为20倍,而芯片电泳图谱在12800倍稀释时其产物的电泳峰仍清晰可见。2.(1)大连地区正常对照组与高血压组中AGT基因(-6)位点A等位基因均有较高的发生频率(0.7038,0.7073),突变位点多态性无统计学差异(χ2=0.024,P>0.05),AG、AA、GG三种基因型分布分别为53.4%、43.7%、2.9%和48.78%、46.34%、4.88%。χ2检验表明在这两种不同的人群中,这三种基因型分布趋势一致,它们之间的差异没有统计学意义(χ2=0.880,P>0.05 ),另外与西藏人群相比,两地A、G等位基因频率分别为70.38%、29.61%和78%、22%,差异也无显著性(χ2=1.663,P>0.05);(2)对于不同性别AGT基因(-6)<WP=6>位点多态性的统计分析显示:两组A、G等位基因频率分别为70%、30%和71.04%、28.96%,两者之间不存在差异。(3)在>60岁与≤60岁两个年龄组人群中基因型AG、AA、GG频率经检验两组分布差异无显著性(χ2=0.572, P>0.05);两组等位基因A、G频率分布趋势一致,分布差异也无显著性(χ2=0.216, P>0.05)。3. TB基因特异性扩增片段240bp与HCV基因特异性扩增片段93bp分别在270S、210s内得到分离检测,具有100%的灵敏度和特异性,且检测限接近是杂交梳的12800倍;实时荧光PCR法的检测限是5×102拷贝/微升,而芯片电泳检测限是0.03125×102拷贝/微升。结论:1. 微流控芯片同琼脂糖凝胶电泳相比,分析速度快,耗样量少,检测灵敏度高,并且芯片电泳自动化程度高、操作简单,将为大规模人群基因多态性分析及寻找致病基因提供一崭新的检测手段。2. 大连地区汉族人群中AGT基因核心启动子区域-6位点等位基因A有较高的分布频率,但G/A的基因变异与EH发病不相关联,此位点可能仅仅是一个基因多态性标志。3. 微流控芯片用于临床常见的病原体基因检测,具有结果直观、分析时间短、操作简单、高效灵敏、方法经济及易于实现高通量等特点,可为临床病原体的检测提供一方便灵活的操作平台。