论文部分内容阅读
溃疡性结肠炎相关结肠癌(Ulcerative Colitis related Colon Cancer,UCRCC)是溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)严重并发症之一,是UC患者死亡的重要原因。随着炎症的进展,UC发生癌变的危险逐渐上升。因此对有较高风险的人群进行干预显得尤为重要。对于UCRCC的治疗,临床上经常用手术切除与化疗作为主要的治疗方法,然而当前所用化疗药物的不良反应大、选择性差、容易产生耐药性,中药以其多成分、多靶点的特点,在炎症相关癌症的治疗中优势突出。葛根芩连汤在前期表现出良好的抗UC作用,其主要通过NF-κB通路实现干预作用。NF-κB通路也是UCRCC的重要通路。因此,本论文对葛根芩连汤干预UCRCC的药效作用和主要化学成分进行研究,以期为后续的谱效关系、药效物质及质量控制提供依据。(1)通过AOM/DSS法建立小鼠UCRCC模型,并通过苏木精-伊红染色法验证该模型,结果直观观察模型组小鼠第一周期结束,黏膜腺体有大范围的破坏,部分上皮细胞脱落,浅表溃疡形成;部分观察腺体排列紊乱,黏膜层内有炎症细胞浸润;第二周期结束,可见腺管排列稍紊乱,核深染,部分核明显拉长;第三周期结束,可见肿瘤腺管排列紊乱,结肠表面可见多个大小不一的癌结节,结肠细胞排列松散,细胞核较大呈深蓝色。随着造模周期的延长出现了炎细胞浸润、腺体排列紊乱以及不典型性增生等癌前病变。上述结果表明UCRCC模型复制成功。(2)前期研究发现葛根芩连汤能够改善UC,主要通过NF-κB通路实现干预,NF-κB 也是 UCRCC 的重要通路,UCRCC 的发展建立在 UC 的基础上,故推测葛根芩连汤通过调控NF-κB通路影响UCRCC。因此,本部分首先采用网络药理学的方法,通过Cytoscape软件建立NF-κB与UCRCC的交互网络图,依据Degree和Betweenness两项指标,筛选出NF-KBp65、iNOS、COX-2、Bcl-2、TNF-αα、IL-1β、ICAM-1 和VCAM-1,8个综合排名靠前的关键炎性因子;利用HE染色、免疫组化和酶联免疫,考察葛根芩连汤对上述关键炎性因子的影响。利用苏木素/伊红(HE)染色评价小鼠结肠上皮的异型增生程度。为了探究葛根芩连汤发挥对结肠炎相关性结肠癌的抑制作用的可能机制。免疫组化法测得正常组、模型组、葛根芩连汤高、中、低剂量组和5-ASA干预模型组中的NF-κBp65阳性细胞表达率分别为:10.89±1.10、34.90±2.34、18.84±2.30、19.24±1.92、24.30±1.54、19.81±1.82%。iNOS的阳性细胞表达率分别是:9.40±1.80、37.80±5.31、17.60±3.10、18.40±6.32、24.40±4.50、18.31±2.00%。Bcl-2的阳性细胞表达率分别是:11.50±1.30、46.80±5.93、20.32±2.80、22.80±2.72、27.30±3.64、21.86±2.48%0 COX-2的阳性细胞表达率分别是:8.40± 1.10、26.30±6.83、19.40±2.30、19.70±1.64、21.20±1.32、18.60±2.700%;葛根芩连汤高、中、低剂量组与模型组相比,小鼠结肠组织中NF-κBp65、iNOS、COX-2和Bcl-2阳性表达相比有非常显著性差异,各药物干预组较模型组的表达量明显降低(p<0.01)。酶联免疫法检测空白组、模型组、葛根芩连汤高、中、低剂量组和5-ASA干预模型组小鼠血清中TNF-α含量分别为50.34±17.36、100.22±16.46、76.44±15.48、78.38±13.79、88.63±10.37、92.93±15.38ng/mL;IL-1β含量分别为28.16±17.45、31.81±29.29、20.41±11.06、30.25±12.98、42.30±15.93、17.64±11.05ng/mL;ICAM-1 含量分别为 47.48± 9.19、108.04±16.75、63.98±16.98、86.99±12.37、97.97±9.34、83.65±11.18ng/mL;VCAM-1 含量分别 为 5.35±4.28、19.78±15.60、14.55±9.58、18.77±5.97、19.44±12.60、19.19± 6.51ng/mL;葛根芩连汤各治疗组小鼠血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1和VCAM-1较模型组均有不同程度的降低,且与模型组相比具有非常显著的差异(p<0.01);。以上实验充分证明了,葛根芩连汤对UCRCC有良好的干预作用。(3)采用HPLC建立了葛根芩连汤的指纹图谱,在前期预实验基础上,优化了两个洗脱系统,最终确定葛根芩连汤指纹图谱的最佳洗脱系统为乙腈-0.2%磷酸水;洗脱梯度条件为 Omin:15%乙腈,1Omin:30%乙腈,25min:40%乙腈,40min:80%乙腈,50min:100%乙腈,55min:15%乙腈;最佳检测波长为250nm。在此基础对葛根芩连汤主要化学成分进行含量测定,方法学考察结果表明线性关系、精密度、重复性、稳定性均良好;葛根素、大豆苷、甘草苷、药根碱、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的加样回收率分别为:100.05±0.07、100.20±0.87、99.84±0.93、99.92±1.73、100.08±1.69、99.66±1.77、100.37±0.88、99.21 ± 1.96、99.97±0.42、97.92±1.65%;测得葛根素、大豆苷、甘草苷、药根碱、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的含量分别为1.677±1.45、0.154±0.21、0.159±0.31、0.045±0.15、0.448±2.48、0.035±0.26、0.095±0.25、0.013±0.10、0.111±0.31、0.006±0.06μg/g。综上所述,本实验对葛根芩连汤干预UCRCC的药效学,以及葛根芩连汤的化学成分进行了研究,能够为日后谱效关系、药效物质和质量控制的研究奠定基础并提供依据。