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目的:体外扩增卡氏肺孢子虫55kDa抗原(p55)基因及690bp的基因片段,构建原核表达载体pGEX/690,诱导表达重组蛋白。
方法:取肺孢子虫肺炎大鼠肺组织制备卡氏肺孢子虫(Pc)DNA,并以此模板扩增p55基因,将PCR产物与pGEM-T载体连接,转化E.coliDH5a,在含氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上筛选出重组子,提取质粒、酶切鉴定及测序验证插入的DNA片段,并进行序列比较分析;接着,用生物信息学知识分析p55蛋白理化性质和抗原表位等;最后,用RT-PCR扩增p55基因690bp片段,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,筛选出重组子、提取质粒双酶切、PCR、测序鉴定;并以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物。
结果:PCR扩增获得长度为1286bp的序列,测序结果与报道的基因序列相比,有三处核苷酸不同,同源性为99..8%,推导的氨基酸序列完全相同。RT-PCR扩增的片段为708bp,将其克隆入pGEX-4T-1中,构建重组质粒,双酶切获得了一个大小与其相应PCR扩增产物一致的插入片段,测序验证读码框架完全正确。用IPTG诱导表达,重组质粒在大肠杆菌中表达出p55与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在,与生物信息学预测的蛋白可溶性结果相一致。重组蛋白分子量约为56kDa,表达量占菌体总蛋白的11.09%。
结论:本研究从卡氏肺孢子虫DNA中成功获得p55基因、成功构建了p55cDNA重组原核表达质粒pGEX/690,并表达出融合蛋白。表达产物与生物信息学预测的可溶性结果一致。p55基因的克隆与表达,为进一步开展p55蛋白的结构、生物活性以及p55致病机制、基因工程疫苗等研究奠定基础。