论文部分内容阅读
PCR技术具有超高的灵敏性和强大的扩增放大效应,可把痕量核酸甚至仅几个分子在几小时内数百万倍扩增富集,从而使不易检测的物质方便检测,使可以检测的物质达到痕量检测.该研究利用PCR技术指数级扩增的特性,结合核酸酶保护分析技术,进行蛋白质的检测和miRNAs的检测,大大提高了蛋白质检测的灵敏度,降低了miRNAs检测的难度,初步建立了两种分子生物标志物灵敏、易行、价廉的检测方法.该研究分两部分:1基于aptamer和核酸外切酶保护分析技术的超灵敏蛋白质检测方法设计策略:Aptamer是通过体外筛选技术从随机寡核苷酸库中筛选出的一段寡核苷酸序列,它对相应的靶分子有很高特异性和很高亲合力.核酸外切酶I(ExoI)催化3末端羟基的单链寡核苷酸从3端向5端降解,产生5单磷酸脱氧核苷和末端二磷酸二核苷.以凝血酶aptamer为例,利用aptamer和ExoI的特性,以PCR扩增为基础,我们建立了一种凝血酶高灵敏的检测方法称作外切酶保护分析(Exonuclease ProtectionAssay,EPA).EPA-PCR凝血酶检测:将特定浓度的凝血酶稀释为四个浓度梯度系列,相邻浓度相隔2个数量级,外切酶保护分析处理,连接产物PCR扩增.同时将与连接产物序列一致的标准品稀释成四个浓度梯度10<-15>~10<-9>M,相邻浓度相隔两个数量级,进行PCR扩增.EPA一实时PCR凝血酶定量检测:将标准品浓度系列(10<-15>~10<-9>M)和凝血酶浓度系列(2.75×10<-13>~2.75×10<-5>M)连接产物进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR,检测.2 microRNAs的检测利用miRNAs长20~25nt、单链、3羟基、5磷酸的特点我们设计了一段与miR-122a序列有关的59nt寡核苷酸片段和两端的linkers.然后检测肝脏、心脏和脑组织中miR-122a的含量.该试验利用液相杂交技术和核酸酶保护分析原理,创建了一种简单、价廉、灵敏度高的miRNAs的检测方法,有望成为又一种检测miRNAs的方法.各种寻找miRNAs的方法和策略都有独特的优点,将各种策略方法联合使用,鉴定已知的miRNAs,发现新的miRNAs,从而深入透彻的了解miRNAs的世界.