目的研究自体表皮细胞悬液与自体微粒皮联合修复深度创面的效果，为特大面积深度烧伤创面修复提供实验基础。方法1.大鼠表皮细胞分离培养与基因标记（1）用1.25g/L中性蛋白酶消化大鼠背部皮肤，分离表皮，2.5g/L胰蛋白酶消化表皮，体外分离培养原代表皮细胞（epidermis cells，ECs），免疫组织化学法检测细胞的抗原表达，将原代细胞随机分为两组，改良组和传统组，改良组细胞采用低浓度(0.25g/L胰蛋白酶)消化液消化传代，传统组采用传统浓度（2.5g/L胰蛋白酶）消化液消化传代，锥虫蓝染色法计数细胞存活率，噻唑蓝比色法检测贴壁细胞数量（以吸光度值表示）。倒置相差显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞周期，β-半乳糖苷酶染色法计数衰老细胞比率。（2）利用含RFP基因的慢病毒，以不同感染复数（MOI值分别为0,5,20,50,100）转染ECs，荧光显微镜下观察RFP的表达情况，流式细胞仪检测细胞转染效率，MTT法评价转染慢病毒对ECs增殖的影响，确定最佳病毒感染复数。2.动物模型建立与创面修复（1）动物模型建立：16只成年SD大鼠随机分为2组，模型组和对照组。每组8只。将大鼠麻醉，刮毛、消毒后，在背部量取3.3cm×3cm(纵长横短)皮肤范围，切除标记范围内的全层皮肤至深筋膜层，形成全层皮肤缺损创面。模型组创面周围缝合3.3cm×3cm钢丝圈，对照组不作处理，两组大鼠创面交叉移植同种异体中厚皮，纱布打包固定。术后7d拆除敷料，并于术后7d、14d、21d使用数码相机照相，采用图像分析软件(Image J,V1.30)计算两组大鼠创面收缩率。（2）创面修复：50只成年SD大鼠随机分成5组，微粒皮（1:10）移植组，微粒皮（1:20）+细胞悬液移植组、微粒皮（1:20）移植组、细胞悬液移植组、空白组对照组，每组10只。制作大鼠全层皮肤缺损创面抗挛缩模型，将各组移植物分别移植到相应创面，覆盖异体中厚皮（异体皮来自25只成年Wistar大鼠）。观察大张异体皮成活情况及脱落时间，用数码照相结合图像分析软件(Image J,V1.30)测量创面愈合率。于术后14d、21d取组织块以甲醛固定，制作病理切片，HE染色，免疫组织化学染色检测Ⅳ型胶原与层黏连蛋白表达。微粒皮（1:20）+细胞悬液移植组大鼠，表皮细胞荧光标记后移植，使用小动物活体成像技术检测创面荧光表达。结果1.大鼠表皮细胞分离培养与基因标记（1）消化培养得到的细胞经免疫组织化学染色，表面表达CK19和CK14等表皮细胞标志抗原，证实分离出的细胞为表皮细胞。首次传代细胞改良组细胞存活率[（94.56±1.74）%]显著高于传统组[（66.22±2.57）%,t=15.815, P<0.05]；传代细胞接种1h、12h、24h，改良组贴壁细胞吸光光度值（0.205±0.015,0.225±0.014,0.265±0.021）均显著高于传统组（0.176±0.015,0.196±0.011,0.221±0.019, t值分别为2.947,3.517,3.476, P值均小于0.05）。细胞经5次传代后，镜下观察改良组细胞为圆形或小的多角形，或呈鹅卵石样铺满瓶底；传统组细胞胞体变大，增殖缓慢，呈片状覆盖瓶底；改良组S+G2/M期细胞所占百分率[(30.55±2.29)%]显著高于传统组[(17.01±5.58)%, t=3.890, P<0.05]；改良组衰老细胞比率[（10.87±2.01）%]显著低于传统组[（75.93±4.11）%, t=24.624, P<0.05]。（2）显微镜下观察细胞发现，转染24h后有微弱荧光，48h后荧光增强，72h后荧光更强。当以MOI=5,20,50,100转染细胞72h后，RFP阳性表达率分别为1.68%,17.15%,47.53%,69.90%；病毒转染72h后，MOI=0,5,20,50,100各组细胞吸光度值分别为1.14±0.143,1.05±0.073,1.02±0.090,1.03±0.141,0.912±0.102，组间比较差异有统计学意义（F=3.022，P<0.05），两两比较MOI=0未转染组和MOI=5组细胞吸光度值高于MOI=100组（P<0.05）。2.动物模型建立与创面修复（1）动物模型建立：术后7d、14d、21d，模型组创面收缩率分别为（1.3±0.5）%,（1.9±0.9）%,（2.6±1.3）%均显著低于（8.6±1.2）%,（37.4±2.6）%,（65.0±3.7）%（t值分别为15.911,36.581,44.847，P均小于0.05）。（2）创面修复：①大体观察：术后5d，异体皮颜色红润，术后14d异体皮干燥，开始脱落。术后21d异体皮基本脱落，空白组大鼠异体皮脱落时间晚于实验组。异体皮脱落后，微粒皮（1:10）移植组，微粒皮（1:20）+细胞悬液移植组、微粒皮（1:20）移植组、细胞悬液移植组创面均可见成片的上皮。大鼠创面愈合率：微粒皮（1:10）移植组创面愈合率为（84.3±11.9）%，微粒皮（1:20）+细胞悬液移植组创面愈合率为（74.2±8.0）%，微粒皮（1:20）移植组创面愈合率为（59.2±10.8）%，细胞悬液移植组创面愈合率为（53.8±11.5）%，空白组创面愈合率为（22.7±5.5）%，组间比较差异有统计学意义（F=34.446，P<0.05），两两比较，微粒皮（1:10）移植组与微粒皮（1:20）+细胞悬液移植组两组间差异无统计学意义（P>0.05），均显著高于微粒皮（1:20）移植组（P<0.05），细胞悬液移植组创面也可愈合但上皮薄，易液化，空白组创面愈合率均显著低于各实验组（P<0.05），残余大部分肉芽创面。②组织学观察：HE染色，镜下观察，术后14d，微粒皮（1:10）移植组，微粒皮（1:20）+细胞悬液移植组、微粒皮（1:20）移植组、细胞悬液移植组新生上皮排挤异体皮，使其与创面部分分离，术后21d，异体皮脱落，微粒皮（1:10）移植组，微粒皮（1:20）+细胞悬液移植组、微粒皮（1:20）移植组表皮分层明显，与正常大鼠皮肤表皮相比，表皮层明显增厚，基底层呈柱状排列，细胞悬液移植组表皮层含有较多空泡，空白组术后14d异体皮下无上皮细胞层，术后21d，异体皮脱落，可见肉芽组织。微粒皮（1:10）移植组，微粒皮（1:20）+细胞悬液移植组、微粒皮（1:20）移植组表皮-真皮连接层Ⅳ型胶原与层黏连蛋白有表达，细胞悬液移植组、空白组无表达，仅在真皮层新生血管处有部分表达。③小动物活体成像观察：荧光标记细胞移植，创面有荧光成像。结论1.低浓度胰蛋白酶消化法能减轻细胞损伤，提高细胞活性、增加传代次数，为实验研究创造良好条件。2.慢病毒介导的RFP基因能够表达于大鼠表皮细胞中，转染效率与MOI值具有量效关系， MOI值为50可作为转染表皮细胞的合适MOI值。3.大鼠全层皮肤缺损创面创缘缝制钢丝圈可有效减轻创面挛缩。4.微粒皮与表皮细胞悬液联用，可提高创面愈合率，减少裸露创面，该方法可显著提高自体皮的利用效率，为大面积深度烧伤创面修复带来新思路。