本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为模型,首先考察了β-伴大豆球蛋白对幼龄草鱼生产性能,肠道发育与肠道细胞凋亡的影响,并探究了β-伴大豆球蛋白引起草鱼各肠段细胞凋亡的相关分子机制。其次,采用体外消化方式消化β-伴大豆球蛋白,并从中确定出能引起草鱼肠细胞凋亡的消化产物。第三,为探究β-伴大豆球蛋白消化产物引起的细胞凋亡与细胞骨架之间的关系,本研究从出芽酵母中筛选出能鉴定草鱼肠细胞细胞骨架F-actin的新蛋白,探索了β-伴大豆球蛋白消化产物引起草鱼肠细胞凋亡的“上游”机制;通过添加p38MAPK蛋白磷酸化抑制剂,进一步探究了β-伴大豆球蛋白消化产物引起草鱼肠细胞凋亡的“下游”机制。第四,通过添加Gln,考察了Gln对β-伴大豆球蛋白消化产物引起的草鱼肠细胞凋亡的保护作用与方式。主要研究内容和结果如下:1.日粮β-伴大豆球蛋白对草鱼生产性能,肠道发育与细胞凋亡的影响试验方法:选择240尾(13.77±0.10 g)健康幼龄草鱼,随机分为对照组和β-伴大豆球蛋白组(8%β-伴大豆球蛋白等氮替代对照组中酪蛋白),每个处理组3个重复(40尾鱼/重复),进行7周生长试验。主要研究结果如下:1.1日粮β-伴大豆球蛋白对草鱼生产性能与肠道发育的影响与对照组相比,β-伴大豆球蛋白显著降低幼龄草鱼增重百分比,特异生长率,摄食量,饲料效率,肠重,肠长,肠重指数,前、中、后肠皱襞高度(P<0.05)。结果表明,日粮β-伴大豆球蛋白能降低草鱼生产性能,并可能与抑制肠道发育有关。1.2日粮β-伴大豆球蛋白对草鱼肠段细胞凋亡的影响及可能机制在草鱼前肠组织中,与对照组相比,日粮β-伴大豆球蛋白未引起DNA片段化现象;对caspase-3,-8,-9酶活性;对Fas L,Apaf1,BAX,BCL-2,MCL-1,IAP,caspase-2,-3,-7,-8,-9,JNK与p38 MAPK等分子的m RNA水平;对T-p38 MAPK与P-p38 MAPK蛋白表达水平均无显著影响(P>0.05);趋于降低ROS浓度(P=0.09);显著降低NOX活性;显著降低NOX1,NOX2,DUOX,P22,P47,P67,NOXO1a,NOXO1b与DUOXA m RNA水平(P<0.05)。结果表明,日粮β-伴大豆球蛋白未促进草鱼前肠组织细胞凋亡,可能与其不能激活细胞凋亡相关信号通路有关。在中肠组织中,与对照组相比,日粮β-伴大豆球蛋白能加剧DNA片段化现象,增加180bp DNA片段含量;提高caspase-3,-8,-9活性(P<0.05);增加Apaf1,BAX,MCL-1,caspase-3,caspase-9,JNK与p38 MAPK m RNA水平(P<0.05);趋于增加IAP m RNA水平(P=0.09);未改变caspase-2,caspase-7,Fas L,TNF-α与BCL-2的m RNA水平(P>0.05);下调caspase-8 m RNA水平(P<0.05);提高T-p38 MAPK与P-p38 MAPK蛋白水平(P<0.05);有增加ROS浓度的趋势(P=0.07);提高NOX2,P47,NOXa1与NOXO1b m RNA相对表达水平(P<0.05)。以上数据表明,日粮β-伴大豆球蛋白可能通过增加线粒体凋亡途径相关分子(Apaf1与BAX)表达水平,激活Caspase-9,起始线粒体凋亡途径,导致草鱼中肠组织细胞凋亡。在后肠组织中,与对照组相比,日粮β-伴大豆球蛋白能加剧DNA片段化,显著增加180bp DNA片段的含量,caspase-3,-8,-9活性(P<0.05);降低Fas L,Apaf1,BAX,BCL-2,MCL-1,IAP与JNK m RNA水平(P<0.05);上调TNF-α,caspase-3,-7,-8与p38 MAPK的基因表达(P<0.05);极显著或显著增加T-p38 MAPK(P<0.05)与P-p38 MAPK(P<0.05)蛋白表达量;显著增加ROS浓度,NOX活性,NOX2,P22,P47,NOXa1与NOXO1b m RNA水平(P<0.05)。结果表明,日粮β-伴大豆球蛋白可能通过增加TNF-α,caspase-8等死亡受体相关分子的表达;并通过增加NOX相关基因表达与酶活性增加ROS含量,从而激活p38MAPK分子,增加caspase酶活;最终促使草鱼后肠组织细胞凋亡。2.β-伴大豆球蛋白消化产物对草鱼肠细胞凋亡的作用动物试验结果表明:β-伴大豆球蛋白对草鱼前肠细胞凋亡无显著影响,但能够促进中肠与后肠细胞凋亡,且凋亡机制存在差异。这可能与不同肠段存在不同的β-伴大豆球蛋白消化产物有关。为确定引起草鱼肠道细胞凋亡的β-伴大豆球蛋白消化产物,需开展以下研究:试验方法:模拟试验一中草鱼肠道对食糜的消化,提取消化道内的消化酶,确定酶:料比,体外消化β-伴大豆球蛋白。试验设两个组:CON-BC,试验一对照组鱼肠道消化酶体外水解β-伴大豆球蛋白;BC-BC,试验一β-伴大豆球蛋白组鱼肠道消化酶体外水解β-伴大豆球蛋白;采集0.5h、1.5h、2.5h、3.5h、5.5h与7.5h的消化样品,进行SDS-PAGE电泳检测,比较两个处理组对β-伴大豆球蛋白的消化差异。根据消化产物分子量大小,采用超滤法纯化BC-BC组消化产物,并处理草鱼肠细胞,以探明引起草鱼肠细胞凋亡的真正β-伴大豆球蛋白消化产物。试验共考察7个物质(β-伴大豆球蛋白及其0.5h、1.5h、2.5h、3.5h、5.5h与7.5h消化产物)对草鱼肠细胞凋亡的影响;每种物质,设5个浓度梯度处理组,每个处理3个重复,分别添加0、1、2、4和8 mg/m L待考察物质。细胞接种于12孔板中培养48h后,分别添加7种待考察物质处理肠细胞24h。收集细胞样品,用于DNA片段化分析。结果表明:CON-BC组中β-伴大豆球蛋白的α’-亚基和α-亚基分别经0.5h与1.5h被降解为约60k Da和50k Da大小的多肽;而在BC-BC组中,分别需要1.5h与5.5h才能将它们降解为与CON-BC组相同的产物。在CON-BC与BC-BC组中,β-伴大豆球蛋白的β-亚基在7.5h时内均不能被消化。超滤能进一步分离纯化β-伴大豆球蛋白6个消化时间点的消化产物。并发现5.5h与7.5h消化的β-伴大豆球蛋白能诱导草鱼肠细胞发生DNA片段化。以上结果表明,β-伴大豆球蛋白难以被草鱼肠道消化酶消化降解;而且长期饲喂β-伴大豆球蛋白日粮的草鱼更难消化β-伴大豆球蛋白;5.5h与7.5h消化的β-伴大豆球蛋白水解产物是诱导草鱼肠细胞凋亡的真正“效应物”。3.β-伴大豆球蛋白消化产物对细胞骨架介导的草鱼肠细胞凋亡的影响试验一结果发现,日粮β-伴大豆球蛋白能通过激活线粒体凋亡通路,调控p38MAPK磷酸化水平等“下游”凋亡执行过程,促使草鱼中、后肠细胞凋亡;试验二进一步确定了促使草鱼中、后肠细胞凋亡发生的β-伴大豆球蛋白消化产物。真核生物上的研究发现,细胞骨架变化作为细胞凋亡的“上游”信号能诱导细胞凋亡。为深入探究β-伴大豆球蛋白消化产物诱导细胞凋亡过程中与细胞骨架和p38MAPK的关系,需构建一个能检测草鱼肠细胞细胞骨架的探针,并通过添加p38MAPK磷酸化抑制剂进一步确定其作用。因此,我们开展了以下两个方面的研究:3.1细胞骨架F-actin检测探针的构建试验方法:从出芽酵母数据库中筛选出能与细胞骨架F-actin结合的潜在蛋白,通过在酵母体内定位模式的鉴定与检测、体外结合分析等一系列操作,将其标记上绿色荧光蛋白(GFP)作为细胞骨架F-actin的检测探针。最终,将该探针通过脂质体转染的方法转染进入草鱼肠细胞,检测草鱼肠细胞细胞骨架。结果发现:Ecm25蛋白C-端中的cable结构域是能与细胞骨架F-actin结合的潜在蛋白。通过在酵母体内的定位模式鉴定与活细胞成像分析,体外的融合蛋白纯化以及与F-actin的直接结合检测,确定Ecm25(cable)能作为细胞骨架的检测探针。通过脂质体转染的方法将Ecm25(cable)探针转染进入草鱼肠细胞,该探针能在草鱼肠道活细胞中表达,并呈现出细胞骨架F-actin的定位方式。表明,本试验成功构建了能用于草鱼肠道活细胞中检测细胞骨架F-actin的荧光探针,为后续β-伴大豆球蛋白消化产物在细胞骨架介导细胞凋亡方面的研究提供了技术支撑。3.2β-伴大豆球蛋白消化产物诱导草鱼肠细胞凋亡的机制试验方法:本试验共设四个处理组,分别为对照组,对照+p38MAPK磷酸化抑制剂组,处理组[添加8mg/m L 7.5hβ-伴大豆球蛋白消化产物(7S-7.5h D)],处理+p38MAPK磷酸化抑制剂组(共同添加8mg/m L 7S-7.5h D,p38MAPK磷酸化抑制剂),每个处理3个重复。草鱼肠细胞接种于12孔板中培养24h;进行质粒转染,继续培养24h;添加p38MAPK磷酸化抑制剂2h,最后添加8mg/m L的7S-7.5h D处理细胞24h。结果发现:对照组中草鱼肠细胞骨架F-actin呈极性分布,即从细胞的一端到另一端;单独添加7S-7.5h D后,细胞骨架F-actin多聚化且失去极性,即随机围绕在细胞膜周围;单独添加p38MAPK磷酸化抑制剂对细胞骨架F-actin的定位模式并无显著影响;共同添加7S-7.5h D与p38MAPK磷酸化抑制剂后,细胞形态正常,细胞骨架定位、分布与对照组相似,但细胞质中出现碎片化细胞骨架。此外,与对照组相比,单独添加7S-7.5h D能显著增加片段化DNA(180bp)与ROS的含量,T-p38 MAPK与P-p38 MAPK蛋白表达水平(P<0.05);能极显著或显著地提高caspase-3(P<0.01),caspase-8(P<0.01)与caspase-9(P<0.05)酶活性。与单独添加7S-7.5h D处理组相比,共同添加7S-7.5h D与p38MAPK磷酸化抑制剂有降低片段化DNA(180bp)含量与T-p38 MAPK蛋白水平的趋势(0.05<P<0.1);能显著降低P-p38 MAPK蛋白水平(P<0.05);显著降低caspase-3,-8,-9酶活(P<0.05)。以上数据表明,7S-7.5h D可能是通过引起细胞骨架F-actin的变化,从而增加ROS含量,激活p38MAPK信号分子,引起caspase相关酶的活性增加,最终导致草鱼肠细胞凋亡。4.Gln对β-伴大豆球蛋白消化产物引起细胞凋亡的作用为考察Gln是否具有保护草鱼肠细胞免受β-伴大豆球蛋白消化产物凋亡诱导的作用与可能方式。需开展两方面的研究:首先,摸索Gln保护草鱼肠细胞免受β-伴大豆球蛋白消化产物凋亡诱导的作用与最适浓度;其次,在明确Gln具有保护作用并确定浓度情况下,考察Gln保护草鱼肠细胞免受β-伴大豆球蛋白消化产物凋亡诱导的可能方式。4.1摸索Gln对β-伴大豆球蛋白消化产物引起细胞凋亡的作用试验方法:试验共设6个处理组,分别为对照组,β-伴大豆球蛋白7.5h消化产物处理组(添加8mg/m L 7S-7.5h D),在β-伴大豆球蛋白7.5h消化产物基础上添加不同浓度Gln组(添加0.7、1.4、2.8与5.6 m M Gln),每个处理3个重复。细胞接种于12孔板中培养24h;添加不同剂量的Gln继续培养细胞24h;再添加8mg/m L 7S-7.5h D处理细胞24h。收集细胞用于DNA片段化分析。结果发现:与7S-7.5h D处理组相比,随着Gln浓度的增加,7S-7.5h D引起的DNA片段化程度逐渐降低,当Gln为2.8 m M时与对照组无显著差异,Gln添加到5.6 m M时与对照组完全一致。表明,Gln能保护草鱼肠细胞免受7S-7.5h D诱导的细胞凋亡,且5.6 m M Gln具有最适的保护作用。4.2 Gln对β-伴大豆球蛋白消化产物引起细胞凋亡的作用方式试验方法:试验共设3个处理组,分别为对照组,β-伴大豆球蛋白7.5h消化产物处理组(添加8mg/m L 7S-7.5h D),7S-7.5h D处理+Gln组(添加8mg/m L 7S-7.5h D与5.6m M Gln),每个组3个重复。细胞接种于12孔板中培养24h;进行质粒转染后培养24h;添加Gln继续培养细胞24h;最后添加8mg/m L 7S-7.5h D处理细胞24h。结果发现:添加7S-7.5h D能导致草鱼肠细胞凋亡,细胞骨架多聚化并失去极性,随机围绕在细胞膜周围;添加5.6 m M Gln在一定程度上能保护细胞骨架免受7S-7.5h D的破坏。表明,Gln可能通过保护细胞骨架的方式保护草鱼肠细胞免受7S-7.5h D应激导致的细胞凋亡。综上所述,日粮β-伴大豆球蛋白降低幼龄草鱼生产性能,可能与其诱导肠道组织细胞凋亡有关;日粮β-伴大豆球蛋白对中肠与后肠造成了细胞凋亡,且中肠与后肠细胞凋亡的机制存在差异,日粮β-伴大豆球蛋白可能通过线粒体凋亡途径起始中肠细胞凋亡,而通过ROS介导的线粒体凋亡途径与死亡受体途径共同促进后肠细胞凋亡;中、后肠细胞凋亡过程均受到p38MAPK信号分子的调控。体外消化试验结合细胞培养试验的结果发现,能诱导草鱼肠细胞凋亡的物质是β-伴大豆球蛋白5.5h与7.5h消化的产物。进一步研究发现,β-伴大豆球蛋白7.5h消化的产物可能是通过引起细胞骨架F-actin的变化,从而增加ROS含量,激活p38MAPK信号分子,增加caspase酶的活性,最终导致草鱼肠细胞凋亡。此外,Gln可能通过保护细胞骨架的方式保护草鱼肠细胞免受β-伴大豆球蛋白7.5h消化产物诱导的细胞凋亡。