增塑剂邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DBP)是一种环境化学物质,也是一种广泛分布的环境内分泌干扰物,可引起睾丸发育不全和精子生成障碍等男性生殖功能问题。睾丸炎症与男性生殖功能紊乱密切相关,然而孕鼠暴露于DBP是否会导致子代小鼠睾丸炎症尚未得到研究。本研究在孕鼠DBP暴露后子代小鼠睾丸组织中观察到组织结构的改变以及炎症反应,进而探讨了睾丸中支持细胞(Sertoli cells,SCs)产生炎症反应的相关分子机制。一.目的1.观察孕鼠DBP暴露对子代小鼠睾丸组织结构的影响;2.探究孕鼠DBP暴露诱导子代小鼠睾丸SCs炎症的分子机制。二.方法1.建立DBP暴露的动物模型;2.在组织水平,利用H&E染色子代雄性小鼠睾丸组织切片的方法观察睾丸组织结构;3.利用q RT-PCR、免疫荧光和免疫组化等方法检测或观察子代小鼠睾丸中的炎症水平;4.在细胞水平,利用q RT-PCR、ELISA、Western blotting和细胞免疫荧光等方法检测或观察睾丸SCs暴露于不同浓度MBP(Monobutyl phthalate,DBP体内代谢物)后的炎症水平和NF-κB等炎症通路及其上下游的变化;5.采用细胞免疫荧光、Western blotting、ELISA、q RT-PCR检测无细胞毒性的NLRP3特异性抑制剂INF39对MBP诱导的炎症的抑制作用等;6.在动物和组织学水平,采用q RT-PCR、Western blotting、免疫荧光、免疫组化等方法检测Pellino2(Peli2)依赖的NLRP3炎性小体和下游蛋白的激活情况。三.结果1.H&E染色结果显示子代小鼠睾丸组织结构破坏,曲细精管和生精细胞数量减少,生精细胞排列紊乱或脱落。2.子代小鼠睾丸组中TNF-α、IL-6、MCP-1和CXCL-10四个炎性因子基因表达上调;TNF-α和IL-6的免疫荧光共定位结果显示二者位置基本重合,多表达于睾丸组织的曲细精管间,且随着DBP浓度的增加,表达量逐渐增加;间质中的巨噬细胞的数量随着DBP给药浓度的增加而增加,且高浓度组由于血睾屏障的破坏出现巨噬细胞进入曲细精管内部的现象。3.MBP染毒SCs细胞株TM4细胞后,TNF-α、IL-6、MCP-1和CXCL-10处于持续高表达状态,MBP染毒原代培养的SCs后,TNF-α和IL-6处于持续高表达状态。4.MBP染毒TM4细胞1 h后,Western blotting检测发现NF-κB信号通路已激活,随着染毒时间延长,NLRP3、CD36、caspase-1、IL-1β、Peli2蛋白表达均有显著上升;无细胞毒性的NLRP3特异性抑制剂INF39对MBP诱导的炎症具有显著的抑制作用。5.子代小鼠睾丸组织中NF-κB/NLRP3信号通路在DBP诱导下被激活;NLRP3依赖蛋白Peli2在DBP诱导的子代小鼠睾丸组织中表达量增加。四.结论1.孕鼠DBP暴露后子代小鼠的睾丸组织紊乱,曲细精管发育异常,高浓度组精子发育异常,或无精子产生,提示睾丸损伤。2.孕鼠DBP暴露后子代小鼠睾丸组织出现炎性细胞聚集,表明有炎症产生。3.睾丸SCs暴露于MBP后NF-κB信号通路在1 h内被激活,并将信号传递至下游,导致NLRP3炎性小体的激活,参与DBP诱导的睾丸炎症的产生。