研究背景:骨肉瘤是对青、少年危害最大的原发的恶性骨肿瘤,以往以手术切除(截肢)治疗为主。患者不但要承受因肢体残缺造成的肉体和精神的严重创伤,而且其5年生存率不超过20%,对于患者及其家庭来说都是一个灾难。即使现在采用各种保肢手术辅助术前、术后的化疗,可以大大提高五年生存率,并很大程度的保留患者的肢体功能,从而明显提高患者的生活质量,但仍有近四分之一到三分之一[1](国内文献报道为40%—50%[2])的患者生存期不超过5年。如何提高化疗的有效率,减少骨肉瘤的复发和转移,是目前临床中对骨肉瘤治疗的研究重点。近来,很多肿瘤学的研究把重点放在了肿瘤干细胞的领域[3]。肿瘤干细胞具有无限增值,自我更新和多向分化的能力,而且肿瘤干细胞多处于静止期,对化疗不敏感[4]。经化疗之后,肿瘤体内干细胞比例明显提高,是产生化疗耐药性和肿瘤复发的主要原因。骨肉瘤保肢手术联合辅助术前、术后化疗的综合治疗后,骨肉瘤的复发与转移是由于骨肉瘤干细胞的存在的原因。目前,骨肉瘤的诊断和治疗发展处于一个瓶颈期,如何有效杀伤肿瘤内的干细胞,减少肿瘤体内干细胞的比例,是提高治疗效果的有效途径。CD133是一种跨膜糖蛋白,先后被发现于造血干细胞和正常干细胞[5,6],后来又被发现于大多数肿瘤干细胞膜,现作为广谱的标记物被应用于肿瘤干细胞的分辨与分离。目前,CD133是筛选骨肉瘤中肿瘤干细胞的常规公认的关键性标识[7,8],所以,我们在本实验中亦把CD133基因的表达作为肿瘤细胞呈现干细胞特性的标志。MicroRNA(miRNA)是一族非编码的小分子RNA(长度平均约为22个核苷酸),在基因转录后水平发挥重要的调控作用,通常引起翻译抑制、目标退化和基因沉默,对人的生命过程具有重要意义。其中,许多miRNA作为原癌基因或是抑癌基因,在肿瘤的发生、发展和转移中扮演重要的角色。miR-21作为致癌的miRNA,在不同的恶性肿瘤的侵袭、血管浸润和转移中起重要作用[9-11]。有研究证实miR-21在骨肉瘤细胞中有高表达,以及miR-21促进骨肉瘤的生长和转移。同时,研究证实miR-21在多种恶性肿瘤的干细胞中亦有异常表达,并通过蛋白或基因的相互作用来调节恶性肿瘤干细胞的功能[12];另外,有研究证实miR-21的抑制剂(反义寡核苷酸链)可以提高某些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[13-15]。VEGF是对血管内皮细胞具有特异性的肝素结合的生长因子,是人体内主要的促血管生成因素。在肿瘤生长时,在多种促癌因素作用下肿瘤组织内VEGF及其受体的表达激增,肿瘤组织内大量不规则的新生血管生成,为肿瘤组织生长提供充足养分,同时为肿瘤的侵袭和转移提供通路,参与到肿瘤的生长、浸润和转移各个过程中[16]。研究证实VEGF在骨肉瘤的发生发展和转移中发挥重要作用;而在其他恶性肿瘤中,miR-21通过增强VEGF表达,从而促进肿瘤的生长和转移[17,18]。因此,在我们关于miR-21在骨肉瘤的发生、发展、转移和肿瘤干细胞的调控作用的研究中,引入VEGF,一是可以作为对照来分析miR-21的作用,另外可以分析miR-21与VEGF在对骨肉瘤干细胞的调控作用的相关性。目的:本课题主要研究阻断miR-21和VEGF作用后不同骨肉瘤细胞VEGF基因和/或CD133基因表达的变化,以及对骨肉瘤细胞生长的影响,证实miR-21对于骨肉瘤及其干细胞有调节作用。并结合VEGF对骨肉瘤及其干细胞特性的调节作用进行对照分析,旨在初步探讨miR-21对骨肉瘤及其干细胞特性的影响及其可能的作用机制及规律,以期找出在临床中能有效抑制骨肉瘤干细胞的发生、发展,减少骨肉瘤肿瘤干细胞比例的治疗措施。方法:1.细胞及细胞培养:选择人骨肉瘤CRL-1543 and CRL-1423细胞系作为实验细胞,按照ATCC推荐的细胞培养液和培养条件及操作步骤进行培养。2.实验一 Realtime-PCR 实验2.1对两个细胞系的种植培养分3个实验组,分别为Oh(初始)对照组,8h阻断组,24h阻断组,每组包括2孔1543细胞和2孔1423细胞,按照前面所述的细胞培养方法进行培养。2.2对两个细胞系的处理将三组细胞在C02细胞培养箱中培养24小时后,所种植细胞完全贴壁后收获初始对照组细胞。然后,在另两组细胞的2孔中分别加入miR-21(has-mir-21-5p)反义寡核苷酸链和VEGF受体抑制剂,然后,将两个抑制组细胞的培养板放回培养箱继续培养,分别于miR-21 inhibitor转染和VEGF受体抑制剂处理后8小时和24小时收集细胞,作为8小时抑制组和24小时抑制组。对各实验组的各个细胞样品分别提取RNA,然后反转录制备cDNA,进行real time-PCR实验,检测各样本的VEGF和CD133基因的表达。3.实验二细胞免疫组化实验3.1对两个细胞系的种植培养取两个8孔chamber slider(腔室载玻片),分别标记为CD133和VEGF。每个chamber slider均培养两排细胞,上面一排植入1543细胞,下面一排植入1423细胞,每个培养孔内植入10000个细胞,并加入相应的培养液0.5ml,放在孵化器中培养24小时,待细胞完全贴壁。3.2对两个细胞系的处理然后将每排四个培养孔的细胞中第一个孔作为空白对照,第二个孔作为阴性对照,第二个孔的作为VEGF(-)加入VEGF受体抑制剂,第四个孔作为miR-21(-)转染miR-21(has-mir-21-5p)阻断剂。将处理过的细胞再放入培养箱中培养24h,然后进行免疫组化染色实验,检测各细胞样品中VEGF基因和CD133基因的表达。4.实验三细胞划痕实验4.1对两个细胞系的种植培养分三个实验组,分别为空白对照组,miR-21阻断组,miR-21阻断+VEGF抑制组。每组包括2孔1543细胞和2孔1423细胞,按照前面所述的细胞培养方法进行培养。4.2对两个细胞系的处理所有细胞在培养箱中培养24小时,待细胞完全贴壁。然后,在第一组四个培养孔内不加任何阻断剂,第二组四个培养孔内加入miR-21的阻断剂,第三组四个培养孔内加入miR-21阻断剂和VEGF受体的抑制剂。然后,将十二孔细胞培养板放回培养箱中培养细胞,待细胞基本布满培养孔底部,在每个培养孔底部用p200 Pipet tip,经过圆心垂直底面标记线划一道线,用倒置显微镜观察并在划痕上与六条标记线的交点处留取照片;然后继续在培养箱中培养,于4h,8h,24h,48h分别留取照片,测量这6个点位置划痕两侧边缘间的距离,取平均值作为这个培养孔内细胞在这个时间点的划痕两侧边缘间距离,每个细胞系的每组有两个重复试验样品,所以再取平均值即为该细胞系该组细胞该时间点划痕两边缘间的距离,分别计算各个时间点两边缘间距离缩小的比例,分析各个细胞增生和长入的能力的差别。结果1.real-time PCR 实验结果:1.1各细胞系VEGF基因和CD133基因表达的总体变化:抑制VEGF后,1543细胞和1423细胞的VEGF的表达有所减低(p<0.05);而CD133的表达均有明显增高(p<0.05)。阻断mmiR-21后,1543细胞的VEGF基因和CD133基因的表达均有所下降(p<0.05);而1423细胞的VEGF基因和CD133基因的表达均有显著提高(p<0.05)。1.2各细胞系VEGF基因和CD133基因表达随时间变化的规律:(1)抑制VEGF后,1543细胞对VEGF和CD133基因的表达均是先有所升高,随着时间的进展表达逐渐降低,VEGF基因的表达到24h时已经低于初始对照组;在阻断miR-21后,1543细胞对VEGF和CD133基因的表达均有所下降,而且随着时间的进展表达无明显变化。(2)1423细胞在被抑制VEGF后CD133基因的表达和阻断miRNA-21后VEGF和CD133基因的表达,在两个时间点的变化差别均比较显著。其中,抑制VEGF后CD133基因的表达在8小时达到初始对照组的4.13倍,而在24小时则急剧降低到初始对照组的0.79。2.细胞免疫组化实验结果:2.1 1543 细胞为 VEGFlow/CD133high细胞,而 1423 细胞为 VEGFhi8h/CD133low细胞。2.2 1543细胞在抑制VEGF后表现为VEGF基因表达有所下降,而CD133基因表达有所上升;在阻断miR-21后表现为VEGF和CD133基因表达均下调。2.3 1423细胞在抑制VEGF后也表现为VEGF基因表达有所下降,而CD133基因表达有所上升;但在阻断miR-21后表现为VEGF和CD133基因表达均明显上升。3.细胞划痕实验结果:3.1 1543细胞增殖速度明显快于1423细胞。3.2 1543细胞两个实验组(抑制miR-21组和同时抑制miR-21和VEGF组)细胞均较对照组生长速度减慢(p<0.05),两个实验组细胞的生长速度之间无明显差别。3.3 1423细胞经miR-21抑制剂处理后较对照组细胞生长速度减慢(p<0.05),而添加两种抑制剂(miR-21和VEGF受体)的细胞生长速度最慢,差别具有统计学意义(p<0.05)。结论1.阻断miR-21对于VEGF基因低表达的骨肉瘤细胞有较明显的调控作用,而抑制VEGF对于VEGF基因高表达的骨肉瘤细胞有较明显的调控作用。2.抑制VEGF后两种骨肉瘤细胞株CD133基因表达均上调,VEGF可能在骨肉瘤细胞中抑制CD133基因的表达。3.miR-21在VEGF低表达的骨肉瘤中有促进骨肉瘤干细胞的发生和增殖,从而增加肿瘤体内肿瘤干细胞比例的作用。在这一部分细胞中阻断miR-21能更显著的降低骨肉瘤细胞干细胞标志物CD133的表达,可能具有减少肿瘤干细胞的作用。4.对于VEGF高表达的1423细胞,抑制VEGF可以双向调控CD133基因的表达,表现为短时间的促进后长时间的抑制。意义:我们的研究发现在低表达VEGF的骨肉瘤细胞中转染miR-21的反义寡核苷酸链,可以显著下调骨肉瘤细胞VEGF和CD133的表达。VEGF是促进血管新生的关键生长因子,在肿瘤转移和血管新生中发挥关键作用;而CD133是重要的干细胞标志物,反映了肿瘤细胞的干细胞特性。这两个基因表达下降,提示肿瘤细胞促进血管新生的能力和干细胞的比例下降。这提示抑制miR-21的表达可能发挥抑制肿瘤的生长和血管新生以及转移,同时减少肿瘤干细胞比例的作用,可以有效提高化疗效果。而VEGF受体抑制剂能有效的抑制高表达VEGF的骨肉瘤细胞的生长、侵袭和转移,减少瘤体内肿瘤干细胞比例,从而提高肿瘤对化疗的敏感性。综上所述,我们的研究为不同分子特征的骨肉瘤的治疗提供了有价值的基础研究信息,为指导临床用药和治疗提供了帮助。基于我们的研究结果,可以对不同分子特征(VEGF高表达或VEGF低表达)的骨肉瘤使用相应的治疗药物,有助于实现精准用药和精准治疗。