【摘 要】
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研究背景:研究发现,高脂饮食会增加肠道通透性,诱导肠道炎症,破坏肠屏障。而已有研究显示竹节参总皂苷（total saponins of Panax japonicus,TSPJ）具有抗炎、改善肠道屏障功能的作用,然而,TSPJ对高脂所致的肠屏障功能是否有改善作用还有待研究。目的:探讨TSPJ对棕榈酸（Palmitic Acid,PA）诱导体外Caco-2细胞和高脂饮食所致小鼠肠屏障损伤的保护作用,
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研究背景:研究发现,高脂饮食会增加肠道通透性,诱导肠道炎症,破坏肠屏障。而已有研究显示竹节参总皂苷（total saponins of Panax japonicus,TSPJ）具有抗炎、改善肠道屏障功能的作用,然而,TSPJ对高脂所致的肠屏障功能是否有改善作用还有待研究。目的:探讨TSPJ对棕榈酸（Palmitic Acid,PA）诱导体外Caco-2细胞和高脂饮食所致小鼠肠屏障损伤的保护作用,并对相关机制进行初步探讨。第1章:竹节参总皂苷对棕榈酸诱导的Caco-2细胞屏障损伤的保护作用及其机制方法:（1）建立和评估Caco-2单层细胞模型:将对数生长期的Caco-2细胞悬液接种于Transwell中,隔天换液,培养21天,测定跨上皮电阻（Transepithelial electrical resistance,TEER）,当TEER可达到500-1000Ω·cm~2,说明Caco-2细胞单层已形成,可模拟小肠的紧密连接结构;（2）细胞培养基中碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AKP）测定;（3）不同浓度的PA处理Caco-2细胞24h,MTT检测细胞活力,筛选PA适宜浓度,将细胞分为空白对照组（NC）、PA模型组（1m M）、PA+TSPJ低剂量组（1m M PA+50μg/m L TSPJ）和PA+TSPJ高剂量组（1m M PA+100μg/m L TSPJ）;（4）FITC-dextran透过率检测各组细胞的通透性;（5）Western blot法检测各组细胞Claudin-1、ZO-1、Mfn2、p-PERK、p-e IF2α、ATF4的表达。结果:（1）细胞在Transwell中培养21天,其TEER为1500Ω·cm~2左右,在17天以后,Transwell上腔室（Apical side,AP）AKP活力是下腔室（Basolateral side,BL）的5倍,可判定Caco-2细胞已形成完整的单层;（2）MTT结果显示,PA浓度在1m M时,Caco-2细胞活力明显下降;将TSPJ与PA共同处理24 h后,细胞活力在TSPJ为50、100μg/m L时,对PA所致的Caco-2细胞具有明显保护作用;（3）TSPJ可减少改善PA所致Caco-2单层FITC-dextran的透过率,增加紧密连接蛋白Claudin-1的表达,但对ZO-1的表达无明显影响;（4）TSPJ可改善PA所致Caco-2细胞内质网应激相关蛋白p-PERK、p-e IF2α、ATF4的表达;（5）TSPJ可改善PA所致Caco-2细胞线粒体融合蛋白Mfn2的表达。第2章:竹节参总皂苷对高脂饮食诱导的肠屏障损伤的保护作用及其机制方法:（1）将40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组,每组10只,即正常对照组、高脂模型组、TSPJ低(25 mg·kg-1)、高(75 mg·kg-1)剂量组,对照组小鼠给予普通维持饲料,高脂模型组和TSPJ低、高剂量组小鼠均给予高脂饲料,用药组采取灌胃的方法给药,每天给予25 mg·kg-1,75 mg·kg-1的TSPJ溶液,剩余两组给予相应剂量的0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,灌胃频率每天一次,持续喂养3个月后,各组小鼠禁食12 h后,麻醉处死,将其置于冰上快速分离空肠组织,取1 cm近端空肠组织放入4%多聚甲醛中准备包埋备用,剩下空肠组织过液氮急速冷冻,置于-80℃冰箱中保存;（2）苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）观察各组空肠上皮形态;（3）阿尔辛蓝-过碘酸雪夫染色法（Periodic acid Schiff and Alcian blue stain,AB-PAS）染色并统计杯状细胞数量;（4）透射电镜观察小鼠空肠上皮细胞间隙、紧密连接超微结构及线粒体形态的变化;（5）Western Blot法检测Claudin-1、ZO-1和Mfn2的表达;（6）免疫组织化学检测空肠TNF-α、IL-1β、p-PERK、p-e IF2α、ATF4的表达;结果:（1）TSPJ可改善高脂饮食所导致上皮细胞排列紊乱,绒毛断裂,改善肠道形态,增加杯状细胞数量,缩少上皮细胞间隙,增加Claudin-1蛋白的表达,但其对ZO-1蛋白表达无明显影响,且对各组间紧密连接超微结构无明显改变;（2）TSPJ可抑制炎症相关蛋白TNF-α和IL-1β的表达;（3）TSPJ可抑制内质网应激相关蛋白p-PERK、p-e IF2α、ATF4的表达;（4）TSPJ可增加Mfn2蛋白的表达,改善线粒体形态,增加其纵横比。结论:TSPJ可改善高脂饮食所致的紧密连接损伤,肠道炎症,肠屏障功能受损,其机制可能与调节Mfn2介导的PERK信号通路有关。
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