论文部分内容阅读
目的:探索DNA损伤修复通路因子53BP1与骨髓干细胞分化发育的内在联系,我们旨在确定其在骨髓干细胞自我更新及定向分化过程中所发挥的作用,解析53BP1对骨髓干细胞自我更新及分化发育的潜在调控机制。研究方法:为研究53BP1对骨髓干细胞自我更新及分化过程的影响,我们分别观察了细胞分化过程中53BP1的表达情况以及53BP1(-/-)缺失后KSL细胞生长速率、克隆形成能力和表面相应分子标记的变化等。1.通过数据库的查找和比对进行53BP1的生物信息学分析。2.构建53BP1(-/-)全身敲除C57/6小鼠模型,与野生型53BP1分别形成阴性对照和阳性对照,即53BP1(WT/Mut)。3.利用Western blot对53BP1蛋白进行表达水平检测及鉴定。4.DAPI荧光染色观察53BP1(WT/Mut)在小鼠胚胎形成以及胚胎干细胞、C2C12细胞和KSL细胞分化过程中的表达情况。5.应用 BD ProCount Progenitor Cell Enumeration Kit 及 BD Trucount 管,利用流式细胞术进行细胞分选、细胞计数、细胞周期检测以及细胞表面分子标记分析。6.应用免疫共沉淀法检测分析表观遗传学磷酸化修饰蛋白p-H4(k20)、p-H3(k79)、p-ATM和p-53-Ser20。7.利用专业绘图软件Graphpad Prism 8.0及统计软件SPSS 22.0对外周血淋巴细胞的定向分化进行分析,对数据进行方差分析和多重比较,计数资料采用χ2检验,以P<0.05为结果具有统计学显著性意义。结果:1.随小鼠胚胎逐渐发育形成(Day12、Day 16、Day 18)53BP1的表达量逐渐减少;但伴随胚胎干细胞(24h,48h,72h)、成体干细胞C2C12 cells(Day1和Day4)以及KSL cells(Day5和Day10)分化进行,53BP1含量均显著增加。2.53BP1缺失与否(WT/Mut)并不影响处于细胞周期静息期(G0期)的KSL细胞计数(P>0.05),但53BP1(-/-)的缺失使得处于细胞间期(G1期)的KSL细胞计数较野生型53BP1(+/+)明显增加(P<0.05)。并且53BP1(-/-)的缺失使得分化形成的共同髓系前体细胞CMP较野生型53BP1(+/+)明显增加,但却使得共同淋巴系前体细胞CLP较之于野生型53BP1(+/+)显著减少(P<0.05)。3.体外实验中,53BP1(-/-)这一缺失使得培养的KSL细胞增长速率较野生型53BP1(+/+)减慢(Day1,Day5,Day10,Day15),但该缺失却导致使得体外培养的KSL细胞克隆拷贝数明显多于野生型53BP1(+/+)。同时,53BP1(-/-)缺失使得KSL细胞表面Mar/Gr-1+标记百分含量显著增加,但却导致KSL细胞表面CD45+标记百分含量比野生型53BP1(+/+)明显减少(P<0.05),骨髓分析实验结果与上述一致。此外,53BP1(-/-)缺失使外周血淋巴细胞定向分化的单核细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞含量较野生型53BP1(+/+)显著增加(P<0.05)。4.表观遗传学磷酸化修饰分析显示53BP1(-/-)的缺失使得磷酸化修饰的组蛋白4赖氨酸20即p-H4(k20)和组蛋白3赖氨酸79即p-H3(k79)较之于野生型53BP1(+/+)明显增加,但该缺失导致磷酸化修饰的p-ATM和p-53丝氨酸20即p-53-Ser20较野生型53BP1(+/+)显著减少。结论:53BP1参与并影响骨髓干细胞的自我更新及定向分化过程,并且其主要在胚胎形成早期发挥作用。53BP1(-/-)的缺失可影响磷酸化蛋白p-H4(k20)、p-H3(k79)、p-ATM 和 p-53-Ser20 的表达水平。