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TMEM16A(又称ANO1)是一种钙激活氯离子通道,属于TMEM16膜蛋白家族,具有10个跨膜结构域。TMEM16A在多种上皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经元等中广泛表达,具有多种重要的功能,如调节分泌上皮细胞分泌液体,平滑肌收缩,神经和心肌的兴奋等。其功能障碍与癌症、胃肠道疾病、高血压以及囊性纤维化等许多疾病相关。近年来,研究发现在多种癌症中,如乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌等,TMEM16A表达上调,参与调控癌细胞的增殖和迁移。结直肠癌为恶性肿瘤,严重危害人类健康。研究发现TMEM16A在结直肠癌细胞中有表达,其表达可能与结直肠癌的发生与进展相关,因此TMEM16A可以作为研究结直肠癌进展的靶点。在本研究中,利用qPCR、Western blot和免疫细胞化学的方法,检测了人正常肠上皮细胞NCM460、人结直肠腺癌细胞SW480、SW620中TMEM16A的表达。使用TMEM16A抑制剂T16Ainh-A01、Ca CCinh-A01、木犀草素(Luteolin)和TMEM16A激活剂剂Eact、离子霉素(Ionomycin)药,利用CCK-8法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞周期分布情况,Hoechst 33258染色观察细胞核固缩与染色质片段化,细胞划痕和Transwell检测细胞的迁移情况,研究TMEM16A对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响。实验结果如下:1、qPCR、Western blot、免疫细胞化学实验结果:TMEM16A在结直肠癌细胞系SW620、SW480和正常肠上皮细胞系NCM460中均表达;TMEM16A基因的m RNA和蛋白表达水平从高到底依次为:SW620、SW480、NCM460。与NCM460细胞相比,SW620和SW480细胞中TMEM16A的表达显著上调;与SW480细胞相比,SW620细胞TMEM16A表达较高。2、CCK-8法检测SW620、SW480、NCM460细胞的增殖,统计学分析细胞增殖速率,从大到小依次为SW620、SW480、NCM460;划痕实验检测细胞迁移,迁移率从大到小依次为SW620、SW480、NCM460。提示细胞增殖速率和迁移速率的大小与三株细胞系中的TMEM16A表达呈正相关。3、T16Ainh-A01、Ca CCinh-A01、Luteolin三种抑制剂均能抑制NCM460、SW620、SW480细胞的增殖和迁移,T16Ainh-A01的最佳浓度为25μM,Ca CCinh-A01的最佳浓度为12.5μM,Luteolin的最佳浓度为50μM。4、TMEM16A激活剂Eact促进NCM460、SW620、SW480细胞的增殖,NCM460细胞的最佳促进浓度为6.25μM,SW620、SW480细胞的最佳促进浓度为25μM。激活剂Ionomycin能够显著促进NCM460细胞的增殖,其最佳浓度为0.63μM;而对SW620、SW480细胞的增殖没有影响。Eact和Ionomycin均能够促进NCM460、SW480、SW620细胞的迁移,其促进最佳浓度分别为0.63μM和25μM。5、细胞周期检测结果:抑制TMEM16A通道活性(T16Ainh-A01、Ca CCinh-A01、Luteolin)使结直肠癌细胞S期细胞数目比例减少,抑制了细胞的DNA分子的复制,其最佳浓度为25μM、12.5μM、50μM。6、Eact能够使SW620细胞S期细胞数目比例增加,说明加快了SW620细胞DNA分子的复制,加速了细胞周期,促进了SW620细胞的增殖,其最佳浓度为25μM;而对SW480细胞S期细胞数目比例略有增加,但未产生显著性影响,Eact对SW480细胞的周期没有影响。Ionomycin可以使SW620和SW480细胞S期的细胞数量比例略有增加,未产生显著性影响,由此可知Ionomycin对SW620和SW480细胞的周期没有影响。7、Hoechst 33258染色结果显示T16Ainh-A01、Ca CCinh-A01和Luteolin抑制通道TMEM16A活性引起了NCM460、SW620、SW480细胞核固缩和染色体片段化、产生凋亡小体。T16Ainh-A01、Ca CCinh-A01和Luteolin最佳浓度分别为25μM、12.5μM、50μM。8、Transwell检测SW620细胞的迁移,结果显示:抑制TMEM16A活性均能够抑制SW620细胞的迁移。9、Western blot检测EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)标志蛋白—波形蛋白(Vimentin)的表达,Vimentin表达水平从高到底依次为:SW620、SW480、NCM460。结论:TMEM16A在结直肠癌细胞中的表达上调,在具有高转移潜能的结直肠癌细胞中的表达量相对较高。抑制TMEM16A通道活性能够通过阻滞S期DNA分子复制进而抑制细胞的增殖,并能诱导细胞核固缩与染色体片段化、产生凋亡小体;激活TMEM16A通道活性能够促进结直肠癌细胞迁移,而对细胞增殖的影响不大。另外,EMT进程可能是原发灶结直肠癌转化成转移灶结直肠癌的关键因素。因此,TMEM16A可能是影响结直肠癌细胞增殖和迁移的靶点,这为结直肠癌患者的治疗提供了新的策略。