spt23基因对酿酒酵母菌株1015耐热性的影响

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耐受高温酿酒酵母菌株具有发酵速度快、发酵周期短、可降低发酵料液黏度的优点,更适用于同步糖化发酵工艺。同时,高温发酵有利于减少冷却耗能、降低生产成本。因此,具有耐高温乙醇发酵能力的酿酒酵母菌株在工业应用上具有重要意义。为了探索工业用酿酒酵母1015耐高温突变株的耐热机制,本研究通过全基因组和转录组进行了驱动突变基因溯源分析,鉴定出spt23是赋予耐高温性状的潜在关键基因。已有研究发现,spt23通过调控ole1基因而影响细胞膜不饱和脂肪酸合成,从而改变温度耐受性。同时,spt23是一种广泛的转录调控因子,通过参与蛋白质稳态和能量代谢过程对高温耐受产生影响。此外,spt23作为一种转座子抑制子,有可能通过转座子的适应性进化过程对酵母高温耐受性发挥作用,但无明确的报道。因此,本研究通过spt23基因的删除(Del)、过表达(OE)和整合性表达(IE)菌株的生长发酵特征、耐高温水平、关键基因表达水平、细胞膜脂肪酸含量和转座子活力的考察,探讨spt23对酿酒酵母高温耐受性的调控机制,并对不同形式的调控方式的权重进行了评估。通过重组菌株的热处理存活率结果发现,spt23的表达水平与高温耐受呈现相反变化趋势。其中,过表达菌株和整合表达性菌株均不高于野生型;敲除型菌株则显著高于野生型。乙醇发酵结果表明spt23的表达水平与乙醇产量呈现比较明确的负相关。其中,敲除型101530菌株在44 h发酵液乙醇浓度达到(14.0±0.14)%,较野生型提高8.93%,是所有重组型中最高的。通过细胞膜不饱和脂肪酸(TUSLA)含量的测定发现,spt23缺失菌株在受到热冲击后,均会发生饱和脂肪酸含量的增加和不饱和脂肪酸含量的降低。通过测定ole1、acc1、mga2及erg1这些脂肪酸合成相关基因表达水平的测定,发现酿酒酵母spt23基因仅对ole1的基因表达水平有调控作用,而对mga2、acc1和erg1无调控作用。spt23表达量与TUSLA仅存在弱正相关关系,可能是mga2基因的干扰。通过对酿酒酵母LTR序列的扩增子测序,将LTR序列多样性波动用于转座子活力评估。结果显示热休克使转座子LTRα多样性发生波动。温度发生变化时(30℃-37℃),菌株LTR的OTU(t-test,p=0.043)会下降;但Shannon Evenness指数均会上升(t-test,p=0.029)。这说明当环境温度提高时,群体丰富度会下降,群体均匀度会上升。从转座子活力(Ta)的角度看,101530菌株的Ta2在37℃时为0.653,高于30℃(0.627),即热处理后转座子活力升高。同时发现,转座子活力与spt23基因表达水平无显著相关性,但转座子活力是热处理后存活率的决定因素之一。通过比对1015菌株和耐高温突变株101530的转录组分析发现,“蛋白酶体-核糖体-RNA聚合酶II”构成的蛋白质稳态是酿酒酵母耐热能力的重要贡献者,蛋白质的稳态则影响广泛存在与细胞的转录调控作用;spt23可能通过对spt3的调控,对SAGA复合体产生影响,进而影响RNA聚合酶II的环境压力相关的转录活动;而对SWI/SNF复合体可能无影响。建立由总不饱和脂肪酸TUSLA和转座子活力Ta2决定的热处理存活率的线性回归模型Survival=-2.39·TUSLA+69.98·Ta2+152.43(R~2=0.815,p=0.015);在两变量可以解释81.5%总方差的前提下,TUSLA和Ta2的相对影响力为0.83:0.17(LMGTUSLA=0.83,LMGTA2=0.17)。据此构建了一个新的酿酒酵母耐热机制模型,即spt23基因的转录调控和转座子的适应性进化作用共同贡献于酿酒酵母耐热水平。综上,spt23主要通过参与调控细胞膜不饱和脂肪酸含量,贡献于酿酒酵母耐热性,敲除spt23有利于提高乙醇产量;spt23虽然是广泛的转录调控因子,但对耐热性的综合调控作用有限;酿酒酵母的耐热性取决于总不饱和脂肪酸含量和转座子活力(权重比为83:17),但转座子活力与spt23基因无关。spt23对于酿酒酵母耐热性发挥着广泛的、非主导性的作用。这些结果对于今后耐高温酿酒酵母的构建具有一定的指导意义。
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