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丙烯酰胺(acrylamide, ACR)是国际上确认的一种神经毒物,其中毒患者主要是生产和使用单体的作业者,中毒表现尤其易出现在通风不良和缺乏个人防护的工作条件下。在ACR(如丙烯酰胺生产、聚丙烯酰胺合成、污水处理、石油开采、建筑工程灌浆等)的职业接触人群中,职业性损害主要表现为皮肤损害以及神经系统损害,神经系统损害又包括中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)和周围神经系统(PeriPheralnervousSystem, PNS)损害。90%的ACR单体用于生产聚丙烯酰胺(Polyaerylamide, PACR),近年来,石油工业发展迅速,PACR的需求量随之不断增加,因而ACR需求量随之不断增加,危害越来越大,对ACR的研究相应越来越多。但有关ACR神经毒作用的细胞和分子机制尚未完全阐明。有学者认为ACR中毒是由轴浆运输损伤引起的。细胞骨架在轴浆运输中发挥着重要作用,ACR通过作用于轴突细胞骨架蛋白的不同成分而影响轴浆运输,从而导致远端轴突功能改变,导致神经损伤。而细胞骨架蛋白聚集或降解可能是由钙离子依赖性蛋白酶(Calpain)对细胞骨架蛋白分解引起的。Calpain通过影响骨架蛋白在神经系统的病理生理过程中发挥着重要作用。目前认为,CNS损伤后细胞内游离钙离子水平升高,可增强Calpain活性,选择性降解髓磷脂蛋白及多种细胞骨架蛋白。有学者应用免疫组化技术发现脊髓损伤后Calpain的表达增强。实验中选择神经干细胞(neural stem cells, NSCs)进行离体研究,NSCs具有多向分化潜能,在研究神经系统毒性时具有代表性；能进行自我增殖,可提供实验所需的大量细胞。自出生24h内的Wistar新生大鼠脊髓背根神经节(Dorsal Root Ganglion, DRG)获取原代细胞并进行鉴定,获取稳定的细胞株。然后进行细胞ACR染毒,用噻唑兰比色法(MTT)法测定吸光度值,计算细胞存活率以建立ACR对NSCs损伤的染毒模型,在此模型的基础上用钙蛋白酶抑制剂MDL-28170进行干预,建立干预模型。通过测定细胞内钙离子浓度及Calpain活性进一步确定钙蛋白酶抑制剂对ACR诱发NSCs毒性的干预作用。目的1.本实验建立ACR对NSCs的损伤模型,通过Calpain抑制剂MDL-28170抑制Calpain的活性达到抑制ACR引起的NSCs损伤的目的。2.测定细胞内钙离子浓度及Calpain活性,进一步确定ACR对NSCs的损伤及钙蛋白酶抑制剂对这种损伤的干预作用,为后续研究神经丝蛋白(Neuro filament, NF)变化机制、预防ACR暴露工人的NSCs损伤提供参考。方法1.无菌条件下摘取出生24h内新生大鼠的DRG,胰蛋白酶消化后进行接种,通过细胞免疫化学的方法检测巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase, NSE)、胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP)三个指标,以确认所培养细胞为NSCs。进行细胞的传代培养,获取稳定的细胞株。2.对建立的细胞株进行ACR的染毒和MDL-28170干预剂量筛选,用MTT法测定吸光度值,计算细胞存活率来确定染毒剂量和染毒持续时问,建立细胞染毒及干预模型。3.使用Fura-2/AM探针和calpain substrate11分别测定细胞内钙离子浓度及Calpain活性。结果1.原代细胞的获取及鉴定细胞免疫化学染色,NSCs的标志性蛋白Nestin染色呈阳性,而且相同来源的细胞可诱导分化成NSE阳性的神经元和GFAP阳性的胶质细胞。2.染毒及干预模型的建立(1)ACR的染毒浓度为0、1400、2800、4200、5600μmol/L,染毒24小时后,自2800μmol/LACR染毒组开始与对照组细胞存活率存在统计学差异(P<0.05)；染毒48小时后,自1400μmol/LACR染毒组开始与对照组细胞存活率存在统计学差异(P<0.05)。根据上述结果ACR24小时染毒剂量调整为0、2240、2520.2800,3080μmol/L后,染毒后细胞存活率自2240μmol/LACR染毒组开始与对照组存在统计学差异(P<0.05);48小时ACR染毒剂量调整为0、700、840、980、1120.1400μmol/L,染毒后细胞存活率自700μmol/LACR染毒组开始与对照组存在统计学差异(P<0.05)。24小时染毒剂量为0、1050、1400、1750、2100μmol/L时,染毒后细胞存活率自2100μmol/LACR染毒组开始与对照组存在统计学差异(P<0.05)；48小时染毒剂量调整为0、140、350、560.700μmol/L,染毒后细胞存活率自700μmol/LACR染毒组开始与对照组存在统计学差异(P<0.05)o2100μmol/L染毒24小时与700μmol/L染毒48小时可定为实验染毒剂量和染毒持续时间。(2)ACR染毒的浓度和染毒持续时间分别为2100μmol/L染毒24小时与700μmol/L染毒48小时,同时钙蛋白酶抑制剂以65、130、195、260μmol/L的浓度进行干预。24小时干预结果：所有染毒、干预组的细胞存活率均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。65、130μmol/L干预组细胞存活率高于染毒组,差异有统计学意义(P<0.05);195、260μmol/L干预组细胞存活率低于染毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。48小时干预结果：染毒、干预组的细胞存活率均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。65、130μmol/L干预组细胞存活率高于染毒组,差异有统计学意义P<0.05)；195μmol/L干预组细胞存活率与染毒组差异无统计学差异(P>0.05)；260μmol/L干预组细胞存活率低于染毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.细胞内钙离子浓度测定结果与对照组相比：染毒组的钙离子浓度高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；干预组钙离子浓度平均值高于对照组,但差异没有统计学意义(P>0.05)。与染毒组相比：干预组钙离子浓度低于染毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。4. Calpain活性测定结果与对照组相比：染毒组的Calpain活性高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；干预组Calpain活性高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与染毒组相比：干预组Calpain活性低于染毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.成功培养并鉴定了NSCs,建立了NSCs的ACR中毒模型及钙蛋白酶抑制剂MDL-28170对ACR诱发中毒的干预模型。2.ACR可造成NSCs的损伤,引起细胞存活率下降,细胞内钙离子水平升高,Calpain活性增强；MDL-28170对这种损伤有一定的抑制作用,可有效提高细胞存活率,降低细胞内钙离子水平及Calpain活性。3.钙蛋白酶抑制剂MDL-28170对ACR导致的的NSCs毒性有干预作用。