前言：Wnt信号传导通路在肿瘤细胞的增殖和去分化过程中起着非常重要的作用。有大量的研究表明Wnt通路的异常激活与肿瘤的进展密切相关,Axin是小鼠Fused(Fu)gene的产物,最初由于抑制胚胎发育时体轴的形成而被认定为Wnt通路的抑制因子。由于Wnt信号传导通路的异常激活在肿瘤的形成和进展中的重要作用,其主要的抑制因子Axin倍受重视。Axin的过表达不仅能下调β-catenin,而且还能显著的下调TCF-4的转录。但Axin下调TCF-4的具体机制尚不清楚。有文献报道,Axin可以直接或间接的激活p53,而p53和β-catenin都可以影响TCF-4的转录和蛋白表达。因此我们推测Axin可能是通过激活p53和/或下调β-catenin来负向调节TCF-4转录,从而抑制Wnt信号传导通路活性的。　　 为了证实我们的设想,我们构建了3种Axin突变型质粒,来分别阻断Axin与β-catenin和/或p53的交互作用,并将野生型Axin和突变型Axin导入BE1(p53为突变型)和A549(p53为野生型)细胞系,检测Axin、β-catenin、p53和TCF-4的转录和蛋白表达的变化,阐明Axin是否通过β-catenin和/或p53通路来调节TCF-4,进而抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力。　　 DNA甲基化作为DNA序列的修饰方式,是一种重要的表观遗传机制,能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能,在生命活动中起着重要的作用。在肿瘤中抑癌基因的甲基化一直以来研究的重点、热点,在许多肿瘤中,都存在着抑癌基因超甲基化现象,大量的研究表明Axin在众多肿瘤中都有表达下调的现象,很多观点认为是突变导致了Axin的表达下调,但实验证实Axin在肿瘤中突变率极低,并且没有突变热点,所以突变并不是Axin下调的主要原因,通过生物信息学检索我们发现Axin基因上存在着数个CpG岛,所以我们推测Axin基因超甲基化可能是导致其在肺癌组织和肺癌细胞系中表达下调的主要因素。所以我们提出假说:Axin超甲基化是导致肺癌组织中Axin的表达下调的重要因素。然而,无论是在正常组织或是癌症组织中,我们对Axin基因甲基化状态,Axin基因甲基化状态与mRNA表达关系,Axin基因甲基化状态和临床病理因素之间的关系都知之甚少。为了解决上述问题并验证我们的假说,我们用甲基化特异性PCR检测45对肺癌及其癌旁的正常肺组织和三种肺癌细胞系的甲基化情况,并用RT-PCR检测了mRNA的表达,以探讨Axin基因甲基化是否是肺癌中Axin表达下调的重要因素。　　 我们在先前的研究中发现,X-ray照射能使新鲜的肺癌标本中Axin的转录上调(5/10),如果肺癌中Axin基因的超甲基化与Axin转录下调关系密切,那么X-ray照射能否使超甲基化的Axin基因去甲基化并上调Axin的转录,进而抑制肺癌细胞的增殖和侵袭呢。众所周知,不同NSCLC患者对放疗的敏感性也是不同的,另外放疗是一种有可能造成严重副损伤(放射性肺炎、肺纤维化、放射性食管炎和骨髓抑制等)的治疗手段,所以如果在放疗前检测Axin基因的甲基化状态可以成为判断患者对放疗是否敏感的指标,将对临床上的放疗具有十分重要的指导意义。为此,我们对20例肺癌新鲜组织和肺癌细胞系进行X-ray照射,用Real-timePCR和甲基化特异性PCR检测照射后Axin的转录和Axin甲基化状态,用克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测X-ray照射后肺癌细胞生物学行为的改变,以探讨Axin基因甲基化能否成为判断肺癌患者对放疗是否敏感的指标。　　 材料与方法：　　 1、肺癌组织　　 本研究使用的肺癌标本均为中国医科大学附属第一医院胸外科提供的新鲜标本,在-80℃深冻冰箱保存。　　 2、细胞培养及转染本研究采用的8种肺癌细胞系,其中大细胞癌:BE1和H460,腺癌:LTE、SPC、A549和H157,鳞癌:LK2,小细胞癌:H446,除BE1由北大郑杰教授提供外,其余细胞系均购自.ATCC,LK2和A549细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养,其余的细胞在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养(37℃,5％CO2)。转染前一天将细胞铺在60mm的皿中,待细胞密度达到85-90％时,用细胞转染试剂Lipofectamine2000进行转染各种质粒(具体质粒见论文1和2),具体操作步骤按说明书进行。　　 3、RT-PCR、Real-time PCR和甲基化特异性PCR将转染后或X-ray照射后的细胞收集,用Trizol Reagent提取转染后细胞的总RNA,具体操作步骤按说明书进行。用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0,进行RT-PCR实验,用SYBR.PrimeScript RT-PCR KitⅡ试剂盒进行Real-time PCR实验。提取的基因组DNA经紫外分光光度计定量后,经DNA甲基化试剂盒EZ DNAMethylationTM Kit(北京天漠公司)处理,具体步骤按照说明书进行,处理后的DNA产物进行PCR反应。　　 4、Westeran Blot收集转染后或照射后的细胞,按体积比1:5加入蛋白裂解液RIPA及1μPMS,提取总蛋白,蛋白定量。电泳后将蛋白转印到PVDF膜上,然后用3％小牛血清封闭,分别用一抗4℃孵育过夜,二抗37℃孵育2小时后ECL发光,曝光胶片后,蛋白条带经采集后进行灰度值测定,目的蛋白灰度值与内对照β-actin进行标准化后即为其相对蛋白定量。　　 5、MTT法检测细胞增殖转染12h后,将各转染组细胞及对照组细胞接种于96孔板(1×104个细胞/孔),使用MTT检测试剂盒检测细胞增殖情况,连续测4天。吸光度由microplatereader检测,波长570nm。单纯加DMSO试剂的孔作为测量值的内参对照,最终值为测量值减去内参对照值。　　 6、细胞侵袭能力检测细胞侵袭力的检测在24-well transwell(R)中进行,小室中聚碳酸酯膜的孔径为8μm,具体操作按说明书进行。先使用无血清的培养基水化聚碳酸酯膜,而后在膜的上表面铺基质胶(100μg/ml),在转染后24h,将上述转染组及对照组细胞接种在上室(5×104细胞/孔),孵育24h后将侵袭到膜表面上的细胞用甲醇固定,苏木素染色,随机选取10个高倍镜视野进行细胞计数。　　 7、统计分析　　 各组资料利用SPSS for Window13.0进行统计分析。P＜0.05有统计学意义。　　 结果：　　 1、Axin抑制肺癌细胞细胞系的增殖和侵袭能力,并通过β-catenin而不是p53下调TCF-4的转录　　 (1)转染野生型Axin和Axin△P53(与p53结合位点突变)可以明显下调TCF-4的转录和Wnt通路的活性。　　 (2)转染野生型p53可以明显下调TCF-4的转录,但共转染野生型p53和Axin△β-ca(与β-catenin结合位点突变的质粒)不能进一步下调TCF-4的转录。　　 (3)干扰GSK-3β或LiC1处理可以明显的抑制转染野生型Axin和各种突变型Axin下调TCF-4转录的能力。　　 2、Axin基因超甲基化造成肺癌中Axin转录下调　　 (1)肺癌组织和细胞系中存在Axin基因启动子区超甲基化(15/45)和内含子区超甲基化(19/45)。　　 (2)Axin的超甲基化与Axin转录下调关系密切,Axin转录下调的病例中(17/45％)有11例发生了Axin基因超甲基化。　　 (3)转染野生型Axin,能使Axin超甲基化的肺癌细胞系BE1的增殖和侵袭能力受到明显的抑制。　　 3、Axin基因超甲基化的肺癌组织和细胞系经X-ray照射AxinmRNA上调,细胞的增殖和侵袭能力受到明显的抑制　　 (1)X-ray照射Axin超甲基化的肺癌组织和肺癌细胞系后,能普遍使Axin的mRNA表达上调,伴随着Axin基因甲基化程度减弱,去甲基化程度增强。　　 (2)X-ray照射明显的抑制Axin基因超甲基化肺癌细胞系的增殖能力和侵袭能力。　　 结论：　　 1、Axin通过β-catenin而不是p53下调TCF-4的转录。　　 2、Axin基因超甲基化状态是造成肺癌中Axin mRNA表达下调的重要原因。　　 3、Axin基因超甲基化有可能成为判断肺癌患者对放疗是否敏感的指标。