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植物内生真菌是一类多样性十分丰富的微生物资源,近年来逐渐为人们所重视。对具有药用价值、生长于独特环境中或有地域特色的植物进行内生真菌的研究日益成为国内外学者关注的热点。银杏是我国特有珍稀植物,具有“活化石”的美称,其在生长期间很少感染病虫害,且具有药用价值。因此,选择银杏开展内生真菌的研究具有一定的前景。
本研究分别于春、夏、秋三季,从江苏和山东两省的五个主要银杏栽培地采集健康银杏叶片进行了内生真菌的研究。旨在了解银杏叶部组织中内生真菌菌群的多样性和演替变化。实验中共分离得到1971株内生真菌,经显微形态鉴定,分属于2 纲、6 目、9 科、32 属,其中分离频率最高的优势菌群为交链孢属Alternaria,占总菌株数的18.01%、其次为叶点霉属Phyllosticta和丝核菌属Rhizoctonia,分别占总菌株数的14.66%和14.56%。
研究对分离得到的银杏叶部内生真菌进行物种多样性的分析,结果发现其类群组成存在着部位、地区以及季节的差异性,也呈现一定的规律性。具体表现为:
春季叶柄中内生真菌的分离率均高于叶片,而夏、秋两季叶片中的分离率显著高于叶柄;地区差异在分离率上反映为南京>启东>邳州>郯城>泰兴的规律;在三个季节比较中,春季内生真菌的分离率为7.76%,显著低于夏季的19.76%和秋季的25.04%。同时,实验对获得的各内生真菌菌群进行了多样性指数的计算,结果反映出各菌群具有不同的丰富度及均匀度。其中秋季在郯城分离获得的内生真菌菌群Shannon-Wiener 指数最高,为2.7102,而夏季在启东获得的菌群指数最低(1.3902)。Simpson 指数反映出与Shannon-Wiener 指数一致的结论,其值分别为0.9041和0.6992。均匀度指数则显示出春季泰兴菌群的均匀度最高(0.9238),而夏季启东菌群的最低(0.6327)。此外,各菌群之间也具有一定的相似性,南京与郯城、泰兴与启东之间的内生真菌菌群相似度较高,它们之间的Jaccard 指数和Sorenson 指数分别为0.7586、0.7727和0.8627、0.8718。
本研究还在银杏叶部内生真菌物种多样性分析的基础上,应用ISSR 分子标记技术,对江苏、山东两省分离获得的五个银杏内生叶点霉优势菌群共20个菌株样本进行了遗传多样性及遗传结构的分析。实验筛选获得的12 条ISSR 引物共扩增检测出195个位点,其中多态性位点190个,占97.44%。计算出的Neis基因多样性指数、Shannon 多态性信息指数分别为0.2873和0.4450。上述结果表明:银杏内生叶点霉菌群的遗传多样性较高。同时,分析出的菌群Neis基因分化系数Gst(0.3552),基因流Nm(0.9078)则说明菌群内部产生了较大的遗传分化,只有35.52%的变异存在于菌群之间,且菌群间的基因交流不多。这与AMOVA分析得出的菌群间变异占18.51%,菌群内变异占81.49%的结论是一致的。此外,实验基于UPGMA 构建了20个供试菌株的遗传关系聚类图。结果显示20个菌株基本按所属菌群聚类,只有个别菌株与不同菌群的菌株聚在一起。菌群的聚类大致可以分为三个分支:泰兴(TX)和启东(QD)两菌群之间有着很近的亲缘关系,两者最先聚合,进而与郯城(TC)菌群聚类;邳州菌群(PZ)单独分为一支,但与前一分支有一定的亲缘关系;而南京(NJ)菌群则独立于其他菌群单独组成一支。聚类表现出一定的地域性,说明各菌群的亲缘关系与地理分布有着一定的关系。