Wilson病(Wilsonsdisease，WD)，又称为肝豆状核变性(hepatolenticulardegeneration，HLD)，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病。由于铜离子在体内蓄积造成肝脏和脑部为主的全身性病理损害。导致以肝脏和神经系统症状为主的复杂的临床表现，以角膜色素环(Kayser-Fleischerring，K-F环)最具特征性。其生化特征是血清铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)降低和胆道排铜障碍。 WD是一种单基因遗传病，据本科门诊统计该病位居单基因遗传病的第二位。WD致病基因定位于D13q14.3，外显子全长为4398bp,编码蛋白为P型ATP酶，多肽链长1465AA，命名为ATP7B。现已明确WD基因全长约80Kb，含21个外显子及20个内含子。 目前WD的治疗方法包括：①金属络合剂为主的驱铜对症治疗，②锌剂治疗，③肝移植尤其原位肝移植治疗。但这些治疗方法均不甚理想，而WD作为单基因遗传病，最理想的治疗当属基因治疗。基因治疗是指以遗传学原理及基因工程技术为基础，在基因水平修补，矫正，替代缺陷基因或调控其表达的治疗方法。目前应用较多的单基因遗传病基因治疗载体是真核表达质粒和病毒载体。真核表达质粒具有构建相对简单，可在细菌内快速大量扩增等优点。腺病毒载体进入宿主细胞核后以附加体形式存在，不整合进宿主基因组，不存在随机插入的不安全性问题，同时又能高效表达，故WD基因治疗应用腺病毒载体或真核表达质粒较为合适。国内尚未开展WD的基因治疗研究。 Wilson病是我国单基因神经遗传病研究得最深入的几个病种之一。本课题组在梁秀龄教授带领下于二十世纪八十年代初开始了对WD的系列研究。并首次在国内引进了目前常用的WD的动物模型-TX小鼠，该小鼠的遗传背景已明确：其致病基因为atp7b，定位于第8号染色体，突变形式为Mel1356Val，该位点在第8跨膜区，其mRNA转录水平无明显改变。编码蛋白与人ATP7B蛋白的同源性为58％。也表现为肝内铜大量沉积、血清铜和铜蓝蛋白水平下降等。 本研究的目的和意义目前对WD的治疗采用青霉胺等金属络合剂、锌剂、低铜饮食等对症治疗，减少铜的摄入并促进其排出。由于这些只是对症治疗，故患者须终生治疗，且青霉胺等金属络合剂常出现严重的毒副作用而使患者被迫中断治疗。而原位肝移植治疗由于存在难以避免强烈的免疫排斥反应，供肝来源有限，治疗费用昂贵等诸多问题，只能解决部分患者的治疗问题。WD致病基因ATP7B的定位和克隆为WD的基因治疗奠定了初步的基础。本实验在本课题组既往研究的基础上，在国内率先开展WD基因治疗的初步研究和探讨。鉴于ATP7BcDNA长达4.4kb，构建重组腺病毒难度较大，故先构建ATP7B重组真核表达质粒，进行离体和在体水平的基因治疗研究探索，然后进行重组腺病毒的构建，为下一步重组腺病毒的基因治疗创造条件。内容包括： 1.构建ATP7B基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/ATP7B。 2.进行TX小鼠体外皮肤成纤维细胞的培养并进行pcDNA3.1(+)/ATP7B在细胞水平基因治疗的初步研究。 3.以重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B进行TX小鼠基因治疗的初步研究。4.构建ATP7B基因的重组腺病毒载体Ad-ATP7B。 第一章重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的构建实验方法 将pRC/CMV-ATP7B和pcDNA3.1(+)以XbaI和BamHI双酶切后的ATP7BcDNA片段和线性化的pcDNA3.1(+)连接，定向克隆构建pcDNA3.1(+)/ATP7B。挑取阳性克隆进行PCR鉴定和酶切鉴定。并进行ATP7BcDNA的全序列测序。 实验结果PCR及酶切鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的构建成功。ATP7BcDNA的全序列测序发现3个错义突变点，但造成的氨基酸改变不在ATP7B蛋白的高度保守区。 结论本研究对重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的构建获得成功。第二章pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞模型铜代谢影响实验方法 先随机选取4月龄的TX小鼠(WD动物模型)和DL小鼠(正常对照小鼠)各10只，雌雄比例相同。以腹部皮肤进行成纤维细胞的体外培养，测定其铜/蛋白比值(Cu/p，ng/mg)以确定TX小鼠体外培养的成纤维细胞是否可作为WD细胞模型。 pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬时转染TX小鼠体外培养的成纤维细胞，确定pcDNA3.1(+)/ATP7B的最适加入量和加入后细胞最佳收集时间。 再随机选取4月龄的TX小鼠20只，将其体外培养的成纤维细胞平行分成3组，一组加生理盐水，另两组分别加入pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)/ATP7B。分别测定细胞Cu/P比值。 以TX小鼠体外培养的成纤维细胞制备细胞玻片，瞬时转染pcDNA3.1(+)/ATP7B24h后取出玻片进行细胞免疫组化实验，以转染pcDNA3.1(+)和未转染质粒者为对照组。 实验结果10只TX小鼠和DL小鼠体外培养成纤维细胞细胞内铜蛋白比值(Cu/P)分别为(x±S)：(64.25±21.43)ng/mg、(38.43±16.24)ng/mg。前者明显高于后者，二者相比较有显著性差异(组间比较t=3.154，P＜0.01)，故TX小鼠的体外培养的成纤维细胞可作为WD的细胞模型。 pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬时转染后，加入1μgpcDNA3.1(+)/APT7B于24h收集细胞疗效较佳。 TX小鼠体外培养成纤维细胞加入pcDNA3.1(+)/ATP7B后，Cu/P比值较对照组显著下降，P＜0.01。 细胞免疫组化实验显示，转染pcDNA3.1(+)/ATP7B者表达ATP7B蛋白较转染pcDNA3.1(+)和未转质粒者表达显著增强，阳性细胞的胞膜呈棕褐色。结论 TX小鼠离体培养成纤维细胞可作为WD的细胞模型。重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬时转染TX小鼠离体培养成纤维细胞后能够表达并具有排铜作用。 第三章pcDNA3.0/ATP7B对TX小鼠肝铜代谢和肝功能的影响实验方法由于本课题研究中所构建的pcDNA3.1(+)/APT7B经对APT7BcDNA全序列测序发现3个错义突变点，为进一步保证研究的结果可靠性，本实验中采用了另一种ATP7B重组真核表达质粒(其APT7BcDNA序列正确)进行TX小鼠的基因治疗研究。 本研究采用质粒和脂质体混合后进行尾静脉注射的方式。分别给予pcDNA3.0/APT7B0、10、20、50、100、150μg，3d后测定其肝铜含量(ng/mg，即每mg干重的肝组织中铜的含量)，确定合适的治疗的剂量。 然后随机选取36只TX小鼠，随机分成3组，即注射生理盐水组、注射pcDNA3.0组、注射pcDNA3.0/ATP7B组。进行肝脏组织RT-PCR、Westernblot检测及肝铜含量测定。取血进行肝功能ALT测定。 实验结果根据预实验结果，取100μg/只为治疗剂量。RT-PCR和Westernblot结果显示，加入pcDNA3.0/ATP7B组于加入后第3、7、14d均可见阳性条带。但以加入第3d时最明显。加入生理盐水组和加入pcDNA3.0质粒组均未见阳性条带。加入pcDNA3.0/APT7B组与生理盐水组及pcDNA3.0组比较，于加入第3、7d肝铜含量和ALT均显著下降，P值＜0.05，以第3天下降最明显。加入第14d肝铜含量无显著下降，P值＞0.05；ALT显著下降，P值＜0.05。 结论ATP7B基因重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B对TX小鼠的铜代谢有改善作用。 第四章重组腺病毒载体Ad-ATP7B的构建实验方法分别以BamHⅠ+SalⅠ双酶切pcDNA3.0/ATP7B和pDC315，将ATP7BcDNA目的基因片段和线性化的pDC315连接，定向克隆构建pDC315/ATP7B，以PCR和酶切鉴定。pDC315/ATP7B与腺病毒骨架共转染293细胞构建Ad-ATP7B，PCR进行鉴定。 实验结果经PCR和酶切鉴定证实pDC315/ATP7B构建成功。pDC315/ATP7B与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑，说明二者在293细胞中同源重组并包装成功。经PCR证实重组腺病毒载体Ad-ATP7B构建已完成。 结论本实验成功构建了ATP7B外源目的基因序列完全正确的重组腺病毒载体Ad-ATP7B。 创新点1.首次构建了重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B，并以其转染TX小鼠体外培养的皮肤成纤维细胞在细胞水平进行WD基因治疗研究。 2.首次以重组真核表达载体pcDNA3.0/ATP7B治疗TX小鼠，取得了初步的疗效。 3.国内首次成功构建了ATP7B的重组腺病毒载体Ad-ATP7B。 主题词：Wilson病；肝豆状核变性；基因治疗；皮肤成纤维细胞；小鼠；腺病毒载体。