【摘 要】
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[目的]构建在心肌中特异性表达外源性核仁素的转基因小鼠,研究核仁素在整体动物水平能否发挥心肌保护作用。[方法]①利用基因重组技术构建小鼠核仁素基因表达质粒(pcDNA3.1-N
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[目的]构建在心肌中特异性表达外源性核仁素的转基因小鼠,研究核仁素在整体动物水平能否发挥心肌保护作用。[方法]①利用基因重组技术构建小鼠核仁素基因表达质粒(pcDNA3.1-Ncl),转染至H9C2细胞后,采用RT-PCR和Western-blot方法检测小鼠核仁素基因在真核细胞中的表达能力；②将具有表达能力的小鼠核仁素基因序列通过基因重组方法构建心肌特异表达外源性核仁素蛋白的表达质粒(Alpha-MyHc clone 26-Ncl),经酶切、测序验证其准确性；③制备心肌细胞内特异性表达外源性核仁素的转基因小鼠,采用PCR技术鉴定转基因小鼠基因型。采用real-time PCR方法检测转基因小鼠心肌中核仁素基因的相对含量；采用Western-blot方法检测转基因小鼠心肌组织及其他组织中核仁素蛋白的表达。④采用组织切片及HE染色法观察转基因小鼠心肌组织形态；测量心脏重量、体重、心脏重量指数；测量左室压最大上升速率(+LV Max dP/dt),观察核仁素在心肌组织高表达后对小鼠心脏形态功能是否有影响。⑤应用转基因小鼠制备心肌缺血-再灌注损伤模型,检测心肌caspase-3活性、血清肌酸激酶活性和左室压最大上升速率(+LV Max dP/dt)变化,研究核仁素对心肌缺血-再灌注损伤的影响。[结果]①成功构建核仁素真核表达质粒(pcDNA3.1-Ncl)和小鼠核仁素基因的心肌特异性表达载体(Alpha-MyHc clone 26-Ncl),制备了核仁素在心肌组织内特异性高表达的转基因小鼠。②转基因小鼠心肌组织形态、心脏重量、体重、心脏重量指数,以及正常时左室压最大上升速率(+LV Max dP/dt)与野生型小鼠相比无明显差异。③与野生型小鼠相比,核仁素转基因小鼠心肌缺血-再灌注损伤后心肌caspase-3活性降低,血清肌酸激酶活性降低,左室压最大上升速率(+LV Max dP/dt)升高。[结论]核仁素在整体动物水平能减轻心肌缺血-再灌注损伤。
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