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1.研究背景原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,世界上肝癌的发病率和死亡率地域差别较大。中国是肝癌的高发区之一,肝癌的发病率和死亡率分别占所有恶性肿瘤的第3位和第3位。肝癌发生是环境因素和遗传因素相互作用的结果,目前已达到共识的病因包括慢性乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)或/和丙肝病毒感染(hepatitis C virus,HCV)、黄曲霉毒素的暴露、酒精摄入过多及个体遗传因素等。广西是我国肝癌高发地区之一,其发病率和死亡率均高于全国平均水平。广西某些肝癌高发地区存在肝癌家族聚集现象,即在一个家族中发生肝癌的病例数达到2人或2人以上。目前,广西肝癌家族聚集发生机制尚未完全明确。其中,肝癌家族聚集与肝炎病毒感染、黄曲霉毒素、饮用不洁水源等外因的研究较多,而对内在的遗传因素则所知较少。HLA-G是机体一个重要的免疫耐受因子,能够调节多种免疫细胞的生物学功能,发挥免疫抑制的功能。HLA-G与恶性肿瘤的关系是近年来研究的一个热点,HLA-G基因多态性及蛋白的表达与多种恶性肿瘤的发生、发展关系密切。前期研究表明,HLA-G参与了肝炎病毒感染的转归和肝癌的发生、发展过程,但其与肝癌家族聚集的关系研究尚未见报道。本课题应用配对病例-对照研究方法,以广西肝癌高发家族家庭成员为研究对象,选择无癌家族家庭成员作为对照,拟从HLA-G基因多态性和蛋白表达水平的角度,探讨其与肝癌家族聚集性的关系,从遗传学角度去寻找肝癌家族聚集性的危险因素和潜在的预测指标。2.方法(1)样本收集:以来自广西肝癌高发区11个县区的35个肝癌高发家族中140名家庭成员作为实验组。其中,HBs Ag(+)35名,HBs Ag(-)105名。一级亲属57名,二级亲属39名,三级亲属44名。为减少混杂因素的影响,以相同性别、年龄±5岁、相同民族、相同生活环境、相同生活习惯作为配对条件,以140名无癌家族家庭成员作为对照组。所有受试者均接受肝炎病毒血清学标志物、HIV和肝功能等的检测。排除非血缘关系的家族成员,排除甲肝、丙肝、戊肝及HIV感染者。所有受试对象均未接受过抗病毒治疗。收集完整的受试者人口学资料和临床资料。所有研究对象空腹采外周静脉血10m L,分别注入抗凝(EDTA)管(6ml)和有盖普通无菌干燥管(4ml),进行分装,并保存于-80℃冰箱中。抗凝血用于提取外周血白细胞DNA。干燥管血样离心后留取血清进行ELISA法检测s HLA-G抗体的浓度。(2)聚合酶链反应(PCR)结合测序法检测HLA-G基因多态性:采用试剂盒严格按照说明书的步骤进行提取外周血DNA。采用聚合PCR和测序技术对HLA-G基因3’UTR区14bp插入/缺失多态性、+3142C/G、+3187A/G以及位于HLA-G基因第三外显子的HLA-G*0105N等位基因进行多态性分析。并比较不同位点基因型与肝癌家族聚集的关系。(3)采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中s HLA-G的水平:严格按照ELISA试剂盒中说明书要求操作,对所有受试对象外周血中可溶性HLA-G(solube HLA-G,s HLA-G)的水平进行检测,并分析肝癌高发家族家庭成员与无癌家族家庭成员s HLA-G水平的差异。3.结果(1)HLA-G基因多态性与肝癌家族聚集的关系检测结果显示:对于HLA-G3’UTR区而言,14bp插入/缺失基因型频率分布在肝癌高发家族家庭成员组和无癌家族家庭成员组中的差异有统计学意义(c2=8.69,P=0.01)。相对于+14bp/+14bp基因型来说,-14bp/-14bp基因型可能增加肝癌家族聚集的风险(OR=4.00,95%CI=1.38-11.61,P=0.01);而+14bp/-14bp则不能增加肝癌家族聚集的风险(OR=2.54,95%CI=0.87-7.43,P=0.09)。两组的+14bp、-14bp等位基因频率分布差异也有统计学意义(c2=7.88,P=0.01),-14bp等位基因与肝癌家族聚集的风险增加有关(OR=1.70,95%CI=1.17-2.46,P=0.01)。而在本研究中,对于HLA-G+3142C/G位点,基因型和等位基因的分布在肝癌高发家族家庭成员组和无癌家族家庭成员组中的差异都没有统计学意义(c2=2.08,P=0.35;c2=0.28,P=0.60)。+3187A/G位点的基因型分布及等位基因频率在两组中的差异也未见统计学意义(c2=3.35,P=0.19;c2=0.01,P=0.93)。而对于位于第三外显子的HLA-G*0105N的多态性分析发现,在本研究所纳入的研究对象中,只检测到HLA-G*0105NC/C和C/-两种,并没有发现-/-基因型。在分析HLA-G*0105N基因多态性与肝癌家族聚集性的关系时,发现其基因型频率和等位基因频率在两组中的分布并没有显著性差异(c2=0.88,P=0.19;c2=0.73,P=0.39)。(2)s HLA-G与肝癌家族聚集的关系检测结果表明,肝癌高发家族家庭成员血清s HLA-G水平显著高于无癌家族家庭成员(22.83U/ml vs 15.45U/ml,P=0.00)。为排除HBV感染的混杂因素,进一步分析,HBs Ag(+)的肝癌高发家族家庭成员的s HLA-G水平高于HBs Ag(+)的无癌家族家庭成员,差异有统计学意义(32.06U/ml vs21.96U/ml,P=0.04);HBs Ag(-)的肝癌高发家族家庭成员的s HLA-G水平高于HBs Ag(-)的无癌家族家庭成员,差异有统计学意义(23.26U/ml vs12.93U/ml,P=0.00)。而在高发家族中,s HLA-G浓度在HCC先证者的一级亲属、二级亲属和三级亲属中分别为39.84U/ml、19.87U/ml和20.96U/ml。与二级亲属、三级亲属相比,一级亲属的s HLA-G水平显示升高(P=0.00,P=0.00)。s HLA-G的水平在家族中有2例HCC患者的家庭成员组,家族中有3例HCC患者的家庭成员组以及家族中有>3例HCC患者的家庭成员组分别为25.89U/ml,27.66U/ml以及22.38U/ml,s HLA-G在三组中浓度的差别没有统计学意义(P=0.98)。(3)HLA-G基因多态性与s HLA-G水平的关系,分析肝癌高发家族家庭成员组中HLA-G基因多态性与s HLA-G水平的关系,结果显示对于HLA-G 14bp插入/缺失多态性,s HLA-G水平在基因型-14bp/-14bp、+14bp/-14bp和+14bp/+14bp个体中的分别为31.41U/ml,24.14U/ml和17.69U/ml,s HLA-G水平在三组间的差异无统计学意义(P=0.22)。对于HLA-G+3142C/G位点,s HLA-G水平在基因型C/C、C/G和G/G个体中的分别为34.45U/ml,23.64U/ml和23.93/ml,s HLA-G水平在三组间的差异无统计学意义(P=0.15)。对于HLA-G+3187A/G位点,s HLA-G水平在基因型A/A、A/G和G/G个体中的分别为24.14U/ml,27.35U/ml和35.69/ml,s HLA-G水平在三组间的差异无统计学意义(P=0.81)。HLA-G*0105N,s HLA-G水平在基因型C/C和C/-基因型分别为27.35U/ml和25.87U/ml,差异也无统计学意义(P=0.67)。4.结论(1)HLA-G基因14bp插入/缺失多态性与肝癌家族聚集性有关。而HLA-G+3142C/G、+3187A/G位点和HLA-G*0105N可能不是肝癌家族聚集性的危险因素。(2)肝癌高发家族家庭成员外周血中s HLA-G水平升高可能是促进肝癌家族聚集性发生的一个危险因素。(3)在本次研究所纳入的人群中,未发现HLA-G基因多态性与s HLA-G表达水平存在相关性。