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由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的结核病是世界上最严重的细菌性疾病之一。尽管宿主细胞存在着多种清除结核分枝杆菌的策略,但结核分枝杆菌也进化出了对抗宿主细胞杀伤作用的生存机制。研究表明,细胞自噬与结核分枝杆菌的相互斗争,是影响该菌能否在宿主细胞中生存的重要因素。然而,参与这一过程的细菌和宿主相关基因仍未得到详细的阐释。本研究以结核分枝杆菌作为研究对象,通过构建青色或蓝色荧光表达菌株和双荧光指示自噬的巨噬细胞系以及一套能够抑制和激活真核基因表达的CRISPRi/CRISPRa系统作为研究工具,以此来揭示调控结核分枝杆菌在宿主细胞中存活的相关基因。主要研究内容如下:1.青色/蓝色荧光结核分枝杆菌H37Ra的构建。为了方便利用荧光显微镜对结核分枝杆菌的直接观察,我们将能够表达青色或者蓝色荧光蛋白的pMV261-CFP/BFP质粒导入到结核分枝杆菌H37Ra中。通过筛选,得到了能够稳定表达青色或蓝色荧光的结核分枝杆菌。2.双荧光指示自噬的巨噬细胞系的构建。首先,我们将EGFP基因突变为GFPph使其对pH环境更加敏感,并与mCherry和LC3基因进行串联表达。之后,利用CRISPR/Cas基因编辑技术,将GFPph-mCherry-LC3融合基因插入到Raw264.7细胞基因组中。通过多轮的挑斑筛选以及流式技术的纯化,我们获得了高阳性率的GphML-Raw264.7细胞。通过对基因组的测序以及Western Blot技术验证相关蛋白的表达,确认细胞系的构建成功。最后,利用自噬诱导剂进行验证,确认该细胞系可以有效地指示自噬的发生。3.结核分枝杆菌蛋白对自噬干扰的分析。为了探究哪些细菌蛋白通过干预自噬而参与调控结核分枝杆菌长期潜伏于巨噬细胞,我们将经过密码子优化的33个结核相关蛋白与GphML-Raw264.7细胞进行共孵育,通过雷帕霉素诱导自噬发生,在特定时间点利用激光共聚焦显微镜分析自噬的发生状况。结果发现Rv0847处理细胞中绿色荧光点与红色荧光点可以共定位,说明Rv0847可以干扰自噬体与溶酶体的融合。以上结果说明Rv0847可能干扰自噬溶酶体的融合,从而参与结核分枝杆菌在细胞内的存活。4.宿主自噬基因gRNA文库的构建。利用CRISPRi/CRISPRa技术,我们可以在真核细胞基因组上抑制或者激活基因的表达。我们将该系统及相关质粒转染293T细胞,结果显示其可有效地激活或者抑制相关基因的表达。之后,我们筛选了所有参与到自噬过程中的相关基因,并通过NCBI获取基因附近的所有序列信息。通过在线分析软件获取最佳gRNA序列。将得到的gRNA序列分别插入到CRISPRi和CRISPRa质粒中,得到关于宿主自噬基因gRNA的文库。进而为下一步探究结核分枝杆菌胞内存活的相关宿主自噬基因奠定基础。