一、研究背景强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病。疾病特征包括起止点炎、渐进发展的骶髂关节炎以及脊柱关节强直。该病好发于青壮年男性并且发病率较高,由于缺乏典型的早期症状和明确的早期生物标记物,AS通常在第一次临床症状出现后的8-10年时间才能得到明确的诊断。晚期患者脊柱的骨性强直及髋关节的骨性融合将导致患者完全丧失生活和工作的能力,对家庭和社会产生极大负担。脊柱及关节部分的骨化作为AS主要病理特征,目前关于它的发生、发展机制也尚不清楚。因此寻找AS的早期诊断标志物以及探索骨化发生的生物学机制一直是AS研究的热点。自身抗体是多种自身免疫性疾病的免疫标记物,可作为早期诊断,疾病活动度的观测,治疗预后评估等的标志物。由于缺乏类风湿因子,强直性脊柱炎一直被认为是血清阴性脊柱关节病,血清抗体较少被考虑作为生物标记物进行研究。然而,近年来越来越多的证据表明B细胞和相应的体液免疫反应可能通过抗原提呈,抗体产生等方式参与AS的发病过程。因此,本课题试图通过蛋白芯片在AS血液样本中筛选到合适的可以作为AS早期诊断的标志物,并研究自身抗体相应的抗原蛋白在疾病发生发展中的作用及机制,从而为强直性脊柱炎寻找合适的标志物及可能的治疗靶点。二、研究目的第一部分:筛选强直性脊柱炎患者血浆内的自身抗体并扩大样本验证Kaiso蛋白自身抗体在强直性脊柱炎血浆内的表达情况。第二部分:探究Kaiso分子在体内外实验中对成骨分化进程的影响。第三部分:探索Kaiso分子调节成骨分化进程的具体机制。三、研究方法第一部分:(1)HuProt蛋白芯片筛选强直性脊柱炎患者及正常人血浆:经过芯片封闭,芯片杂交,芯片检测,数据提取与分析等步骤筛选出强直性脊柱炎患者血浆内特异性的自身抗体。(2)血浆自身抗体表达水平的验证:基于Meso Scale Discovery(MSD)技术,利用夹心法,即将重组蛋白包被在板底,然后加入含有待测抗体的血浆样本或阳性对照抗体进行孵育,再加入带有sulfo标签的抗待测抗体的二抗,最终利用电化学发光原理检测,从而得出不同血浆样本中的抗体表达水平。第二部分:(1)Kaiso分子过表达、敲减稳转细胞株的建立:通过病毒载体的构建,慢病毒包装,慢病毒感染细胞及嘌呤霉素筛选等实验步骤完成慢病毒感染稳转细胞株的构建。荧光定量PCR及蛋白免疫印迹实验验证过表达及敲减效率。(2)成骨分化的诱导及检测:在培养基中添加50μg/ml抗坏血酸,10 mMβ-甘油磷酸钠,50 ng/ml BMP2重组蛋白进行成骨诱导。在不同时间点使用PCR技术检测骨化相关分子的变化、使用BCIP/NBT法进行染色检测碱性磷酸酶的表达情况、使用碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性、使用茜素红S染色法观察钙结节形成,从而评价不同细胞株成骨分化能力。(3)裸鼠体内异位成骨实验:将Kaiso过表达、敲减及相应对照的稳转株细胞株接种到β-TCP材料支架上,细胞-材料复合物植入裸鼠肌肉内部模拟活体环境,最后通过μCT扫描骨密度值及HE染色观察材料上细胞的成骨情况来评价不同稳转细胞株的成骨能力。第三部分:(1)RNA测序了解Kaiso过表达及敲减后基因表达的变化情况:通过提取RNA,RNA质量检测,建立cDNA文库,上机检测,测序结果分析等步骤检测Kaiso过表达及敲减后差异表达的基因。并进一步进行GO、KEGG分析探究差异基因富集到的生物过程及信号通路。(2)使用PI3K-Akt信号通路抑制剂并加入成骨诱导液进行诱导,探究该信号通路是否参与Kaiso调控的成骨分化进程。(3)Kaiso分子结合的目的基因预测及验证:根据生物信息学分析预测转录因子Kaiso可能结合的目的基因,ChIP-PCR、荧光素酶报告基因实验验证Kaiso与Itga10启动子区域的结合及对Itga10的表达调控。(4)Itga10敲减实验进一步验证Itga10与PI3K-Akt信号通路及成骨分化的关系。四、研究结果第一部分:(1)通过HuProt蛋白芯片筛选强直性脊柱炎及正常人血浆,结果在强直性脊柱炎病人血浆中特异性筛选出MYLK,ASAP,SUGT1,BCL7A,EIF2C1,KAISO,IGHG17等蛋白自身抗体。(2)扩大相应样本量利用MSD技术对其中感兴趣的Kaiso蛋白抗体进行验证,结果显示早期AS患者体内Kaiso抗体表达水平显著高于正常人,晚期AS患者血浆内表达水平与正常人无显著差异。第二部分:(1)通过慢病毒感染技术成功构建Kaiso基因过表达和敲减MC3T3-E1稳转细胞株。使用成骨诱导液分别对Kaiso过表达及敲减稳转细胞株进行成骨诱导,结果发现骨化相关分子、碱性磷酸酶的表达量及活性、钙结节形成等反映成骨分化能力的指标在Kaiso过表达后被显著抑制,而在Kaiso敲减后明显增强。(2)裸鼠体内异位成骨实验证实Kaiso过表达稳转细胞株体内成骨能力低于对照,而Kaiso敲减稳转细胞株体内成骨能力与对照组相比显著增强。第三部分:(1)对RNA测序所得的差异基因进行GO分析发现,Kaiso过表达后下调的基因和Kaiso敲减后上调的基因均能够富集到骨化相关生物过程。KEGG分析发现PI3K-Akt信号通路在Kaiso过表达时被抑制,Kaiso敲减时被激活。其中Itga10的表达变化与PI3K-Akt信号通路变化一致。(2)PI3K-Akt信号通路抑制剂证实该通路参与Kaiso调控的成骨分化进程。(3)ChIP-PCR、荧光素酶报告基因实验发现Kaiso可以通过结合存在于Itga10启动子区域的特异序列从而抑制Itga10的表达。(4)Itga10敲减实验证实Itga10的表达与PI3K-Akt信号通路成正相关,敲减Itga10能够抑制细胞的成骨分化。裸鼠体内异位成骨实验进一步证实敲减Itga10对细胞成骨分化的抑制作用。结论本课题通过三个部分的研究揭示了Kaiso蛋白的自身抗体在早期强直性脊柱炎患者血浆内高表达,进一步探究Kaiso分子与骨化这一强直性脊柱炎病理过程的关系,结果显示Kaiso分子可通过结合Itga10来调控PI3K-Akt信号通路从而抑制成骨分化过程。这为强直性脊柱炎的早期诊断及骨化的干预治疗提供了一个新的可能。