研究背景:　　 抗体在生物医学领域中应用极为广泛,其制备技术经历了多克隆抗血清一单克隆抗体—基因工程抗体三个发展阶段。自70年代德国学者Koehler和英国学者Milstein利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体(McAb)以来,其在临诊断治疗及蛋白质提纯等方面的重要作用日益明显,取得的成果令人鼓舞。但动物源性McAb具有免疫原性,进入人体后会产生不同程度的人抗鼠抗体反应(HAMA)；对清除抗体的器官产生毒性作用；实体组织穿透力差；McAb为异种超敏抗原,对以后注入的McAb失去保护作用,干扰McAb合理分布；此外,McAb成本较高也是难以普及应用的原因之一。　　 基因工程抗体(gene engineered antibodies,GEAs)恰好可以弥补上述不足GEAs又称重组抗体(recombinant antibodies,RAs),是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按人们不同需要进行加工改造和重新装配,经转染适当的受体细胞进行表达的抗体分子。GEAs的特点是低或无免疫原性、组织穿透力强、分子量小、成本低、可规模化生产等。1984年国外首次报道了人一鼠嵌合抗体(chimeric antibody,CA)在骨髓瘤细胞中表达成功,以后又出现了各种形式的小分子抗体和抗体融合蛋白。90年代以来出现的噬菌体表面展示技术,使基因工程抗体技术发展到一个崭新的阶段。噬菌体展示抗体库技术是目前制备人源性抗体的热门技术之一,通过反复几轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,可从大容量的噬菌体展示抗体库中获得能够结合特异性抗原的抗体。但噬菌体表面展示抗体库仅可展示抗体的Fab段或单链抗体(scFv),因此无法直接筛选获得全长抗体；当获得抗体片段后,需要将其改造为全长抗体,而此过程中常存在丢失抗体特异性和亲和力的风险,另外,由于筛选过程应用的是细菌,一旦将筛选获得的抗体基因转入哺乳动物细胞,往往不能表达或表达量很低,难以满足抗体药物研发的需要。　　 近十几年来,采用哺乳动物细胞表面展示系统(mammalian display)成为发展人源抗体的重要方向。哺乳动物细胞中蛋白质的折叠、分泌以及翻译后修饰等过程与人体的最为接近,且应用哺乳动物细胞表面展示系统可展示全长人源抗体。全抗体分子中Fc段介导所有重要的效应功能,包括补体激活和Fc受体介导。IgG1和IgG3具有很强的补体激活功能和依赖特异Fc受体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。但由于目前此技术尚不成熟,全长抗体库构建效率低,库容量小,目前文献报道仅达到106,难以满足高亲和力、特异性抗体的筛选需要。　　 因此,如何提高建库效率,快速构建大容量的哺乳动物细胞表面展示抗体库是一个必须解决的问题。　　 连接和转化效率是构建大容量抗体库的重要因素之一。虽然增加转化的次数也是增大库容的途径之一,但是通过此方法提高库容量,费时费力,使得大容量抗体库的构建难以广泛开展。电穿孔法是大肠杆菌实现高效转化的最有效方法,1μg DNA连接产物可获得约1010个转座子。但是在建库过程中由于PCR扩增、半合成寡核苷酸的引入以及多步酶学反应等因素产生的重复克隆、无效克隆及克隆数的丢失、使实际库容要小得多,因此构建大容量抗体库必须对实验设计和实验条件进行优化,提高单次连接和转化的效率及增加连接与转化的次数。首先高效连接是实现高效转化的重要条件,高效连接决定于载体的性质、限制性内切酶的酶切与连接效率、载体与目的基因的比例。合适的限制性内切酶的选择和合理使用将大大提高连接效率。本研究通过应用一组特殊的限制性内切酶以及本实验室已经构建好适用于快速构建大容量基因库的真核表达载体,构建全长轻链和全长重链抗体基因库。其中,所应用的两种限制性内切酶(SfiI、BsmBI)切割之后的末端均不会自我连接,只有当相匹配的两个末端结合的时候才形成互补而被连接,从而大大提高基因库构建中的连接转化效率,减少了建库的工作量。　　 抗体库技术为新型抗体的研制提供了新的途径。但能否从抗体库中获得预期的抗体受到许多因素的制约,包括抗体库库容、多样性、保存条件、扩增情况以及抗体库的筛选等。而这其中最重要的一步就是要尽量将所有的抗体基因扩增出来,设计并应用一套具有良好扩增效率的引物对于提高库容量,保持抗体库多样性具有重要影响。　　 我们首先根据V-BASE网站的相应信息设计的26对针对抗体重链可变区基因的引物,以及针对抗体轻链(Kappa链)全长基因设计15对引物,应用上述引物在2个月的时间内成功构建的重链基因库和轻链基因库的容量在105～106,将重链库和轻链库共转入哺乳动物细胞后,可以利用细胞本身的天然配对机制,使所展示抗体的多样性达到1010,但是由于引物数目较多,为获得目的基因要做40多次PCR,分别纯化PCR产物,操作繁琐。在此基础上,我们根据引物所对应的抗体亚型的表达强度、扩增难易,优化上述引物组合,各用三组引物分别扩增全套重链可变区和全长Kappa轻链,且在将其纯化回收后又等比例混合,平衡所构建的抗体基因库中各亚型DNA的比例,以保证抗体库的多样性。在两个星期即完成了库容达到1010的全长抗体基因库的构建。　　 目的:　　 快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库　　 方法:　　 1.总RNA的提取以及cDNA第一链的合成　　 取适量静脉血分离外周血淋巴细胞(PBMC)并提取总RNA(按试剂盒中的说明书进行操作),测定总RNA浓度。以总RNA为模板,用特异性的引物逆转录合成cDNA第一条链。　　 2.Kappa型全长基因和重链可变区基因的扩增　　 以合成的cDNA为模板,用相应的特异性引物扩增全套IgG1轻链κ型全长基因及全套IgG1重链可变区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为:94℃预变性5分钟,然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min),随后在延长温度下反应7 min,以确保全长目的片段的合成。用PCR扩增抗体全套Kappa轻链和重链可变区基因上述PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。然后将回收得到的3组重链基因PCR扩增产物,各取700 ng等比例混合成重链基因混合物,再次经1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段备用。并用同样方法处理3组轻链PCR扩增产物。　　 3.轻链基因库及重链抗体基因库的构建及鉴定　　 轻链全长基因的扩增产物经SfiI酶切后回收,与经同样酶切回收的载体pDGB-HC-TM片段用T4 DNA连接酶按1:1比例混合连接,在16℃反应24 h后导入化学转化感受态大肠杆菌DH5α,构建轻链基因库。并取适量转化后的细菌涂于含100 mg/L氨苄青霉素的LB平皿,37℃过夜,根据长出的克隆数计算轻链库容量,收集转化获得的所有菌落即为轻链抗体基因库。以BsmBI对重链基因扩增产物及载体pDGB-HC-TM进行酶切(pDGB-HC-TM经BsmBI酶切后仍携带有重链恒定区),电泳分离纯化片段,将回收的二种基因片段混合连接,并将连接产物转化感受态细菌DH5α。其余构建重链抗体基因库的步骤同轻链基因库的构建。分别从重、轻链抗体库中各挑10个单克隆培养过夜后抽提质粒,测序(广州英俊公司)。　　 4.抗体基因转染CHO细胞　　 细胞转染在12孔细胞培养板中进行,每孔接种4×105 CHO细胞,37℃培养过夜,然后进行细胞转染。取2μg质粒DNA和6μL转染试剂,分别用80μLDMEM稀释,放置2 min后将DNA溶液加入转染溶液,然后将二者的混合液在室温放置25 min后直接加入细胞培养孔中；6 h后换成新鲜培养液；30 h后检测抗体在细胞表面的表达。　　 5.流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达　　 用Cell Dissociation Buffer(Invitrogen)消化转染后的细胞,然后取分散的细胞与荧光标记的特异性抗体进行反应。在50μL反应体系中含有5×105细胞和2μL PE荧光标记的鼠抗人Kappa链的特异性抗体(PE-Kappa),混匀后于冰上孵育30 min,用染色缓冲液洗涤细胞1次,然后将细胞重悬于400μL的染色缓冲液,用流式细胞仪分析抗体基因在细胞表面的表达。用FCS Express V3对表达抗体进行量化分析。　　 结果:　　 构建的非特异性IgG1-Kappa抗体基因库,重链库容量达2.62x105,轻链库容量达2.04×105,理论库容量高达5.3×1010。随机从重链库和轻链库各挑选10个克隆送测序,重链10个克隆的DNA序列分析显示8个含有正确的阅读框架,轻链10个克隆的DNA序列分析显示全部含有正确的阅读框架。流式细胞仪分析显示来自轻链库的10个克隆、重链库的8个克隆均可检测到抗体在CHO细胞表面的表达。阳性对照的阳性细胞比例为44.88％,而所挑克隆阳性细胞比例最高可达61.68％。用所构建的轻重链抗体库共转染CHO细胞,流式细胞仪分析可检测到抗体在细胞表面的表达,阳性细胞比例达到31.5％,说明CHO细胞表面能够成功展示抗体库中的全长抗体。　　 结论:　　 采用本研究建立的哺乳动物细胞展示技术,可在二周内成功构建库容量大且多样性好的全人源抗体基因库,用于高亲和力特异性抗体的筛选。