【摘 要】
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目的:构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3,GPC3）-嵌合型抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）基因、构建分泌程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1,PD-1）抗体的CAR基因及构建靶向GPC3的分泌PD-1抗体的CAR基因慢病毒表达载体,并通过对293T细胞包装后得到的慢病毒进行表达验证。方法:利用PCR
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目的:构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3,GPC3）-嵌合型抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）基因、构建分泌程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1,PD-1）抗体的CAR基因及构建靶向GPC3的分泌PD-1抗体的CAR基因慢病毒表达载体,并通过对293T细胞包装后得到的慢病毒进行表达验证。方法:利用PCR扩增GPC3、PD-1抗体及靶向GPC3的PD-1抗体基因,将扩增的基因片段分别连接至经Bam HI/Bam HI酶切过的线性化GV401载体,然后转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,经PCR鉴定阳性克隆后行DNA测序分析。将测序比对吻合的慢病毒质粒与包装质粒共同转染至293T细胞进行病毒包装,观察荧光表达情况并测定滴度。Q-PCR技术分别检测其中GPC3-CAR、PD1-CAR以及GPC3-PD1-CAR基因m RNA的表达情况。结果:将经PCR成功获得的GPC3基因片段、PD-1抗体基因片段及GPC3-PD1基因片段分别连接到已线性化的GV401载体上,并通过PCR鉴定显示正确。DNA测序证实重组表达的基因与靶基因吻合。慢病毒载体转染293T细胞后观察荧光表达情况,测定其滴度分别为6.0E+06 TU/ml,3E+8 TU/ml及4.0E+06 TU/ml。Q-PCR检测结果显示,与对照组相比,目的基因质粒转染293T后的GPC3-CAR、PD1-CAR以及GPC3-PD1-CAR基因m RNA的表达水平显著升高（p＜0.05）。结论:我们利用慢病毒载体系统重组基因,成功构建了GPC3-CAR、PD1-CAR以及GPC3-PD1-CAR基因过表达的慢病毒载体,并对293T细胞包装获得的慢病毒进行表达验证,为阐明靶向GPC3分泌PD-1抗体的CAR-T细胞在肿瘤微环境下对肝癌杀伤作用的相关机制及后期开展临床试验提供理论与实验基础。
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