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目的:激肽系统(kinin-kallikrein system,KKS)是体内主要的降压系统之一,由激肽原、激肽释放酶(kallikrein ,KLK)和激肽(kinin)组成,在调节血管壁的张力、细胞增殖及基质增生等方面具有重要作用。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见的慢性并发症,也是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病肾病的主要病理表现为肾小球基底膜增厚,系膜细胞增殖,细胞外基质堆积阻塞肾小球毛细血管管腔,肾小球滤过功能丧失。是血管内膜功能异常不断加重的结果。激肽释放酶是激肽系统的主要限速酶,它作用于低分子量激肽原生成赖氨酰缓激肽(kallidin)即激肽,激肽与其受体结合后,通过一系列机制可以抑制肾小球系膜细胞增殖、基质增生。本实验目的:(1)利用基因重组技术制备出人组织激肽释放酶。(2)观察糖尿病大鼠在糖尿病的不同阶段体内激肽系统的活性。(3)将制备出的纯品激肽释放酶注入糖尿病大鼠体内,观察大鼠肾脏功能和形态的变化,以探讨基因重组人组织激肽释放酶对糖尿病肾病大鼠影响。方法:(1)利用基因重组(genetic recombination)制备人组织激肽释放酶。将人组织激肽释放酶基因片段导入分子杆状病毒体内,构建pAd.CMV-cHK质粒,转染Sf-9细胞进行病毒扩增,然后再转染给Hi-5昆虫细胞,进行目标蛋白表达,ELISA方法测定人组织激肽释放酶的表达量。将制备出的激肽释放酶利用离子交换色谱法(ion <WP=5>exchange chromatography,IEC)、凝胶过滤色谱法(gel-filtration chromatography,GFC)、亲和色谱(affinity chromatography,AFC)进行分离,纯化。纯化后人组织激肽释放酶用SDS-PAGE进行纯度测定。(2)将健康雄性Sprague-Dawley大鼠经链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导制成糖尿病模型。设正常对照组(NC)、糖尿病对照组(DM)、人组织激肽释放酶治疗组(DK)。自成模后开始,分别于第8周,12周,16周留取尿标本。16周后应用硝酸酶还原法、放射免疫技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化技术及数字化影像处理等方法,观察各组大鼠血浆KLK变化,肾组织NO、cAMP、 ET-1变化,肾组织形态改变。结果: 1.Hi-5细胞以1X106cells/ml 接种,以10pfu/ml感染复度感染时表达量最高。感染后培养96小时收获细胞培养上清液,分离、纯化后测得人组织激肽释放酶分子量为39604Da。2.DM组与NC组大鼠比较,体重(body weight,BW)、组织激肽释放酶(KLK)活性、肾组织中NO、CAMP含量下降(p<0.01或p<0.05)。而DM组的血糖(blood glucose,BG)、血肌酐(Blood creatinine,BCr)、血尿素氮(Blood ureanitrogen,Bun)、肾重体重比值(Kw/Bw)、内皮素(endothelin-1,ET-1)、尿白蛋白(urine albumin,Ualb)排泄率、24h尿蛋白定量均高于NC组(p<0.01或p<0.05)。 3.DK组与NC组大鼠比较,BW、组织KLK活性、肾组织中NO、cAM P含量下降(p<0.01或p<0.05);而BG、Kw/Bw、Ualb排泄率、24h尿蛋白定量均高于NC组(p<0.01或p<0.05)。DM组、DK组间BG、Bun、Bw、Kw、Kw/Bw无显著性差异,组织KLK活性、肾组织中NO、cAM P含量,DK组明显高于DM组(p<0.01或p<0.05)。而血肌酐、Ualb排泄率、24h尿蛋白定量则显著低于DM组(p<0.01或p<0.05)。4.(1)16周时,DM组组织KLK活性明显低于8周时的水平(p<0.01),明显较NC组降低(p<0.001);而DK组组织KLK活性明显高于8周时的水平(p<0.05),该组病变较DM组轻。(2)DK组12周、16周尿白蛋白排泄率均低于8周时的水平(p<0.05),16周时,DK和DM比较尿<WP=6>白蛋白排泄率有显著性差异(p<0.05)。(3)16周时,DM组肾组织中NO、cAMP含量则明显低于NC组(p<0.01);而与DM组相比, DK组肾组织中NO、cAMP含量较高(p<0.01和p<0.05)。结论:1.利用基因重组技术,可以通过真核昆虫细胞表达人组织激肽释放酶。2.通过尾静脉注射STZ制备糖尿病模型,8周后大鼠处于早期DN,出现蛋白尿。3.糖尿病大鼠体内激肽释放酶活性显著降低。4.给予外源性人组织激肽释放酶可以抑制糖尿病大鼠肾小球系膜细胞增殖、基质增多,可使尿蛋白排泄减少。延缓糖尿病肾病的发展。