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第一部分NA对DRG神经元上GABAA受体表达的影响目的：去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)在背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元上由a-肾上腺素能受体(alpha-adrenoceptor,α-AR)介导可以参与多种受体和通道蛋白的调节,进而调控痛觉信息的传递,而DRG神经元上的GABAA受体也参与了痛觉信息传递调控程序,并且发挥着非常重要作用。已有资料显示,GABA系统在神经病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)产生和发展过程中被下调,那么NA是否参与GABAA受体表达的调节,尚未有资料报道。本实验通过在培养的DRG神经元上施加NA,观察GABAA受体γ2亚基mRNA和蛋白表达的变化,拟阐明NA是否通过对(GABAA受体表达的调节进而参与GABA系统的去抑制程序。方法：Sprague-Dawley (SD)大鼠(160-220g) DRG神经元原代培养。利用免疫荧光技术检测神经元的γ2亚基的分布。细胞培养48h后,分组处理。第一组：在各培养瓶中分别添加NA1μM、NA1μM+哌唑嗪(PRZ,α21-AR阻滞剂)10μM、 NA1μM+育亨宾(YOH,α2-AR阻滞剂)10μM、NA1μM+PRZ10μM+YOH10μM。隔日添加第二次,再隔日进行后续提取RNA程序。实验对照组培养过程中未添加NA和α-AR阻滞剂。第二组：在各培养瓶中分别添加NA0.01μM、NA0.1μM、NA1μM、NA10μM。隔日添加第二次。再隔日进行后续提取蛋白程序。实验对照组培养过程中未添加NA。第三组：在各处理组培养瓶中均添加NA1μM,依次于5h、12h、24h、48h后进入提取蛋白程序。另一培养瓶于48h添加NA1μM后隔日再次添加,再隔日提取蛋白,共施加NA96h。实验对照组培养过程中未添加NA。各组分别提取总RNA或蛋白,进一步利用RT-PCR技术和Western blot技术观察不同处理因素下GABAA受体γ2亚基的表达。结果：(1)DRG神经元培养后免疫荧光染色显示,γ2亚基在大、中、小各直径神经元中均有分布。γ2亚基的免疫反应产物主要分布在细胞膜上,少量分布在胞质中,细胞中心淡染。胶质细胞没有着色；(2)神经元培养后分别给予1μM NA、1μM NA+10μMPRZ、1μM NA+10μM YOH和1μM NA+10μMPRZ+10μMYOH,利用RT-PCR技术检测γ2亚基mRNA的表达。所得结果显示NA和α-AR阻滞剂的各处理组与对照组相比无统计学差异(P>0.05,n=3)；(3)神经元培养后分别给予0.01μM NA、0.1μM NA、1μM NA和10μM NA,利用Westernblot技术检测γ2亚基的表达。结果显示不同浓度的NA各处理组和对照组相比无统计学差异(P>0.05,n=3)；(4)神经元培养后给予1μM NA分别处理5h、12h、24h、48h和96h,利用Western blot技术检测γ2亚基的表达。结果显示施加NA不同时间的各处理组和对照组相比无统计学差异(P>0.05,n=3)。结论：NA在DRG神经元上不参与GABAA受体表达的调控。第二部分在正常大鼠和CCI大鼠DRG神经元上NA抑制GABA电流目的：研究证明,NA在DRG神经元上对疼痛信息的输入有着重要的调制作用。另外已发现在DRG神经元上GABAA受体介导的电流受多种致痛物质的调节,且在NPP过程中,GABA系统下调。本实验通过观察NA在正常大鼠和坐骨神经慢性压榨损伤(chronic constriction injury of sciatic nerve,CCI)大鼠DRG神经元上对GABAA受体介导电流的调制及其机制,旨在阐明在NPP过程中NA是否参与对GABAA受体功能的调节,进而参与GABA系统的去抑制程序。方法：制备酶消化分离的正常SD大鼠DRG神经元,利用全细胞膜片钳技术记录GABA激活电流(IGABA),并观察不同浓度NA对其的调节,进一步施加苯肾上腺素(PHE,α1-AR激动剂)、PRZ (α1-AR阻滞剂)、CLO (α2-AR激动剂)、YOH (α2-AR阻滞剂)、forskolin (FSK, PKA的激动剂)、H-89(PKA抑制剂)、PMA (PKC激动剂)、GF109203X (GF, PKC抑制剂),分析NA对IGABA调控的机制。制备CCI大鼠模型,观察NA在病理情况下对IGABA的调制。结果：(1)IGABA为内向电流。GABAA受体选择性激动剂蝇蕈醇(muscimol, Mus)模拟了GABA的作用,而GABAA受体选择性拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline,Bic)可将IGABA完全阻断,表明在DRG神经元上GABAA受体介导了IGABA;(2)经NA预处理后,IGABA被抑制。在0.01-1μM时NA的抑制作用表现为浓度依赖性增加,随着NA浓度的增加,在10μM-1000μM时又较1μM的作用逐渐降低,在1μM时最强,但在大、中、小各直径的神经元中其作用无统计学差异(P>0.05);(3)α1-AR激动剂苯肾上腺素(phenylephrine, PHE)和α2-AR激动剂可乐定(clonidine,CLO)可部分模拟NA的抑制作用,而α1-AR阻滞剂PRZ和α2-AR阻滞剂YOH可部分反转NA的抑制作用。施加蛋白激酶C(PKC)的激动剂PMA和蛋白激酶A(PKA)的抑制剂H-89,IGABA也被部分抑制。PKC抑制剂GF109203X (GF)和PKA激动剂forskolin (FSK)共同施加后可完全阻断NA的抑制作用；(4)CCI模型大鼠缩爪阈值降低,IGABA显著减(?)(P<0.01),A的抑制作用增强(P<0.05)。结论：NA通过α1-AR/Gq/phospholipase C (PLC)/PKC和α2-AR/Gi/cAMP/PKA两条途径调节IGABA。神经损伤后,NA的抑制作用被增强,可能参与痛觉信息传入的去抑制程序。第三部分CCI诱导α-AR亚型在大鼠DRG中的不同表达目的：大量研究证明,外周神经损伤后DRG神经元中α-AR亚型mRNA的表达会发生改变,但各报道结果不一致,甚至相互矛盾。本研究通过观察正常大鼠和CCI大鼠的腰5(L5)DRG中α-AR各亚型蛋白的表达,以明确神经损伤对α-AR各亚型表达的影响,进一步阐明神经损伤后NA对IGABA作用增强的机制。方法：本实验选用24只雄性SD大鼠(160-220g)。所有大鼠被随机分为3组,即：正常对照组(n=3)、假手术组(n=3)和手术组(n=18)。经戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉成功后,手术组大鼠行左侧坐骨神经结扎。而假手术组大鼠被手术切开后,仅游离坐骨神经,但未结扎。正常对照组的大鼠没有做手术切开。于术前1天和术后14天利用热板实验对所有大鼠测缩爪痛阈。大鼠于术后(?)天经4%多聚甲醛灌注固定后取出L5DRG。正常组大鼠同样处理。所有DRG经OCT胶包埋后于冰冻切片机(-20℃)切成组织切片(10μm)。利用免疫荧光技术孵育抗体,激光共聚焦显微成像系统拍摄,观察各组大鼠DRG神经元中α-AR亚型的蛋白表达和分布。结果：(1)热板实验检测结果显示CCI组大鼠缩爪阈值从23.0±1.0s-减少到11.5±1.0s(P<0.01),而假手术组缩爪阈值术后与术前相比无统计学差异(P>0.05)；(2)在正常DRG的大、中、小神经元中,α1A-AR和α1B-AR蛋白均有表达(α1A-AR,49.4%;α1B-AR,38.2%),而在CCI组DRG的各型神经元中均显著增加(α1A-AR,89.8%；α1B-AR,81.8%)。α1A-AR主要分布在细胞膜和细胞质,偶尔也在细胞核,α1B-AR分布在胞浆和胞核内。CCI术后α1D-AR的表达稍有增加(对照组,48.8%；CCI组,68.5%,P<0.01),且主要是小直径的神经元表达增加,免疫反应产物集中在细胞膜和细胞质,偶尔也在细胞核。α2A-AR免疫反应产物分布于在细胞膜、细胞质和许多细胞核中,阳性神经元占神经元总数的22.8%,术后增加到57.7%(P<0.01),尤其小直径神经元的增加最为明显。而α2c-AR的免疫反应产物主要存在于细胞质,各直径大小神经元均有其阳性的细胞,但CCI术后α2C-AR阳性的比例从44.0%降低至32.2%(P<0.01),其中小直径神经元阳性比例下降最明显。α2B-AR在正常DRG和CCI DRG中均未检测到；(3)α1A-AR和α2A-AR可共存于同一神经元中。双标阳性神经元主要是中直径神经元。双标阳性神经元在CCI组DRG中占的比例明显上调(P<0.01)。结论：α-AR亚型阳性神经元在DRG中有明显的分布,CCI可诱导α-AR各亚型表达和分布呈不同形式的改变。α-AR亚型阳性神经元数量的增加可能参与NA对GABAA受体调节作用的增强程序,在NPP的产生和传递过程中起着重要作用。